一种枸杞番茄红素β-环化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3′RACE技术克隆了番茄红素β-环化酶基因LmLycB，得到完整的基因序列为1506bp。构建了大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的LmLycB基因编码的酶的活性进行了鉴定，LmLycB能够在番茄红素末端添加两个β-紫罗兰酮环而生成β-胡萝卜素。并对玉米自交系幼胚遗传转化体系进行优化，将含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA2300-LmLycB-Bar转化玉米愈伤，最终获得了转基因阳性植株，经HPLC检测，转基因玉米叶片总类胡萝卜素含量为165.70μg/g?FW，比野生型玉米提高了12.76％，其中β-胡萝卜素含量为80.17μg/g?FW，比野生型玉米提高了54.83％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种枸杞(Lycium chinense Miller)番茄红素β-环化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用。
技术介绍
植物类胡萝卜素生物合成途径中，番茄红素的环化反应是其中最重要的分支点， 在线性番茄红素的两端对称环化形成两个紫罗兰酮环，则产生类胡萝卜素。番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)是类胡萝卜素生物合成途径中重要的限速酶，催化番茄红素向β-胡萝卜素转化 目前为止，已从大豆、番茄、辣椒、拟南芥、玉米、黄水仙、野生烟草等植物中分离到LycB基因。类胡萝卜素是C40的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素(carotenes)和它们的氧化衍生物叶黄素(xanthophylls) 两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB(pds)和crtl基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达， 胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体β-胡萝卜素。生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助T细胞的活力，协助B细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定， 为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枸杞番茄红素β -环化酶基因。本专利技术的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本专利技术的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。本专利技术的另一个目的在于提供该基因的用途。本专利技术提供了一种枸杞番茄红素β-环化酶基因LmLycB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列构成。本专利技术提供了一种上述枸杞番茄红素β-环化酶基因LmLycB编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白质。本专利技术提供了一种上述枸杞番茄红素β-环化酶基因LmLycB重组克隆载体 pBS-T-LmLycB。含有上述的枸杞番茄红素β -环化酶基因LmLycB的重组载体，这些重组载体包括质粒和植物表达载体。所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB。所述的重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmLycB-Bar。含有上述枸杞番茄红素β -环化酶基因LmLycB完整编码阅读框序列的宿主细胞， 如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或玉米细胞。本专利技术提供了两种含有LmLycB基因工程菌。上述枸杞番茄红素β -环化酶基因LmLycB的应用包括该LmLycB基因编码的蛋白在大肠杆菌和植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的枸杞番茄红素环化酶基因LmLyc遗传转化获得上述物种转基因植株。本专利技术的技术方案具体概述如下一种枸杞番茄红素β -环化酶基因LmLycB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，还包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。一种含有番茄红素β -环化酶基因LmLycB的重组载体pMON-LmLycB的大肠杆菌 DH5a。一种含有番茄红素β -环化酶基因LmLycB的重组载体pCAMBIA2300-LmLycB_Bar 的农杆菌C58。一种番茄红素β -环化酶基因LmLycB编码的蛋白，如序列表中SEQ ID Ν0. 2所示氨基酸序列。一种番茄红素β -环化酶基因LmLycB编码的蛋白在大肠杆菌中的表达应用。一种番茄红素β -环化酶基因LmLycB编码的蛋白在玉米中的应用。所述的枸杞番茄红素β -环化酶基因还应用于制备转基因大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等植株。本专利技术的克隆方法由下述步骤组成从枸杞叶片中提取总RNA，根据GenBank中其他植物中的番茄红素β -环化酶的氨基酸序列设计简并引物Ρ1，其特征是具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的序列。然后利用 3' RACE方法扩增得到完整的基因序列为1506bp。本专利技术构建含番茄红素β -环化酶基因LmLycB的大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB 和植物表达载体pCAMBIA2300-LmLycB-Bar，由下述步骤组成1)构建含有番茄红素β -环化酶基因LmLycB的中间载体pBS-T-LmLycB 设计由SEQ ID NO. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID NO. 4所示的下游引物P2，以枸杞番茄红素β -环化酶基因的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pBS_T 载体，获得含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的LmLycB基因的中间载体pBS-T-LmLycB。2)构建大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB 设计由SEQ ID N0. 5所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0. 6所示的下游引物P4， 以质粒pBS-T-LmLycB为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和MlI酶切后，将大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB经BamHI和MlI酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pMON-LmLycB。3)构建植物表达载体 pCAMBIA2300-LmLycB_Bar 设计由SEQ ID N0. 7所示的上游引物P5，和由SEQ ID N0. 8所示的下游引物P6， 以质粒pBS-T-LmLycB为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和MlI酶切后，将植物表达载体PCAMBIA2300-35S-0CS经BamHI和MlI酶切，二者进行连接反应，得到植物表达载体 pCAMBIA2300-LmLycB。然后利用BioI酶切位点，将PCAMBIA2300-LmLycB载体上的NPTII基因去除，从 5'到3'方向插入了抗草胺膦的Bar基因，得到pCAMBIA2300-LmLyCB-Bar植物表达载体。本本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一个枸杞番茄红素β－环化酶基因，其特征在于选自以下核苷酸序列之一：１）具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的核苷酸序列；２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的７０％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季静，王罡，马然，关春峰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12
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