本发明专利技术涉及一种芽孢杆菌L型诱导培养基，其成功率高、诱导快速。本发明专利技术芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化钠4-6g，琼脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl2?1.7-2.1g，在121℃条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细菌L型的诱导培养基。
技术介绍
细菌L型是细菌因变异而产生的细胞壁缺陷型，细菌细胞壁的缺陷可自发形成， 也可人工诱导，诱导细菌变为L型的因素很多，如抗生素、中药等。国内对细菌L型的研究主要集中在医学领域，由于抗生素的大量使用使得病原菌突变形成L型，L型病原菌可以具有致病性，但由于其缺乏细胞壁，青霉素等作用于细胞壁的抗生素对其没有作用，故L型的产生对疾病的治疗提出了新的挑战，因此国内关于L型的研究主要集中在病原菌L型的防治、检测等方面。但在上世纪90年代，英国阿伯丁大学的研究. Journal of Applied But Feriology, 1984,56(3) :465-477. The L-phaseof Erwinia carotovora var. atroseptica and its possible association with plant tissue · Jappl. Bact. , 1973, 36 :729-737.)]表明 L型细菌在植物体内能够与植物形成内共生关系，并成功诱导了这种关系可使植物在受到病原体胁迫时，抗病效果大大提高，这些研究为植物病害的防治和抗病植物的育种提供了新的思路。蜡样芽孢杆菌是植物的一种益生菌，可以促进植物生长，并可以通过拮抗作用、 竞争作用、诱导植物抗性等抵御植物病害。陈冲等人的研究(陈冲，王程亮，张潞生.蜡样芽孢杆菌TS-02防治草莓白粉病研究.安徽农业科学.2007，35 (11) =3298,3300)表明，蜡样芽孢杆菌可抑制白粉病菌的定殖，从而达到防治草莓白粉病的效果。将蜡样芽孢杆菌诱导为L型，将L型导入植物体形成内共生，可以选育出对白粉病等植物病害具有抗性的新型植物品种。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种成功率高、快速的芽孢杆菌L型诱导培养基。一种芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4_6g，氯化钠4_6g，琼脂9_10g，蔗糖 160-180g, MgCl2 1. 7-2. lg，在121°C条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清IOOmL,再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为l_5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56°C灭活0. 5小时。本专利技术芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g, MgCl2L 9g，在 121 °C条件下灭菌10-60min，冷却后加入灭活马血清IOOmL,再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为l_5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56°C灭活0. 5小时。使用该芽孢杆菌L型的诱导培养基按以下步骤进行诱导1、将芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中，28-32°C振荡培养至芽孢杆菌处于对数生长期；2、取所得芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度为(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度与芽孢杆菌L型诱导培养基中的溶菌酶浓度相等，混勻，置于的恒温条件下，当活体染色显示99%以上的菌体变为球形时，终止溶菌酶的作用，1500-2500r/min离心10-20min收集沉淀，用高渗液洗涤两次后，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1. l)X108CFU/mL，即得去壁菌悬液；3、将灭菌后的芽孢杆菌L型诱导培养基冷却后倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的芽孢杆菌L型诱导培养基平板上待平板凝固后，将平板倒置放入烛缸中， 用CO2烛缸法培养，在观-321的条件下，培养至菌悬液液滴内及液滴的边缘出现直径 0. 4-0. 6mm的颗粒状菌落，验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的芽孢杆菌 L型诱导培养基平板上，每3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过 5-10次转接形成稳定的芽孢杆菌L型；所述营养肉汤培养基的配方为每IOOOmL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、 氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7. 0-7. 2，121°C灭菌20min。所述高渗液的配方为在0. 1-0. 5mol/L、pH6. 0-7. 0的磷酸缓冲液中加入0. 01-0. 03mol/L顺丁烯二酸和0. 01-0. 03mol/L MgCl2,加入蔗糖使其终浓度为 0. 4-0. 6mol/L, 121°C 灭菌 15_60min。所述悬浮液的配方为每IOOOmL蒸馏水中溶有K2HPO4O. 3-0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2-0. 4g，酪蛋白 5-10g,KH2PO4 0. 3-0. 5g,CaCl2 0. 1-0. 5g,MnSO4 0. 01-0. 05g,FeSO4 ·7Η20 0. 002-0. 006g, NaCl 30_60g，用常用酸或碱溶液调节 pH6. 0-7. 0。所述验证菌落为L型菌落的方法为挑取菌落经活体染色观察形态和/或渗透压的敏感性试验和/或滤过性试验，其中所述活体染色观察菌体形态为采用高渗美兰活体染色法。由于芽孢杆菌为杆状， 而细胞壁去掉之后菌体为球状，所以通过菌体性质即可判断是否是L型。所述渗透压的敏感性试验为将细胞放入蒸馏水中，IOmin后观察，细菌破裂，无完整细胞，说明此细胞对渗透压敏感。原始菌体由于有细胞壁所以对渗透压不敏感，L型没有细胞壁，进入低渗溶液会破裂死亡。所述滤过性试验为用高渗液将L型诱导培养基上的菌落洗下，用0. 45 μ m的细菌滤膜过滤，取滤液接种于L型诱导培养基上，32°C培养，接种3天后观察是否有菌落生长。 由于有细胞壁的细菌不能通过细菌滤膜，而L型可以，所以用0. 45um的滤膜过滤后收集滤液，L型菌液的滤液接种于L型诱导培养基上，会有细菌生长。所述稳定的L型的鉴定方法在无溶菌酶的L型诱导培养基中传代3次，采用高渗美兰活体染色法观察菌体形态，菌体为球状，不恢复杆状即认定为稳定的L型。本专利技术芽孢杆菌L型诱导培养基中，单个芽孢杆菌L型诱导培养基平板诱导芽孢杆菌L型的成功率可以达到100%，芽孢杆菌L型在L型诱导培养基平板上，通过(X)2烛缸法培养生长较快，3天即可转接一次，转接5-10次即可得到稳定的芽孢杆菌L型，诱导周期短。具体实施例方式实施例11、将蜡样芽孢杆菌ATCC 10702菌株接种于营养肉汤培养基中，，振荡培养至蜡样芽孢杆菌处于对数生长期。2、取所得蜡样芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度约(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度达到 1. Omg/mL，混勻，置于的恒温水浴锅中，当高渗美兰活体染色显示99%以上的菌体变为球形时，1500r/min离心20min收集沉淀，用高渗液洗涤两次，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0. 9-1. 1) X 108CFU/mL,即得去壁菌悬液。3、将溶菌酶浓度为1. Omg/mL的L型诱导培养基倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的L型诱导培养基上，凝固后将平板倒置本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种芽孢杆菌Ｌ型诱导培养基，其特征在于按照以下步骤制备：每９００ｍＬ蒸馏水中溶有葡萄糖８－１２ｇ，胰蛋白胨８－１２ｇ，酵母粉４－６ｇ，牛肉膏４－６ｇ，氯化钠４－６ｇ，琼脂９－１０ｇ，蔗糖１６０－１８０ｇ，ＭｇＣｌ２ １．７－２．１ｇ，在１２１℃条件下灭菌１０－６０ｍｉｎ，所得培养基冷却后加入灭活马血清１００ｍＬ，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为１－５ｍｇ／ｍＬ，所述灭活马血清为使用前需在５６℃灭活０．５小时。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙治军，王鸿磊，王红艳，张梅，丛慧芳，
申请(专利权)人：山东省烟台农业学校，
类型：发明
国别省市：37
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