一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法技术

本项发明专利技术涉及一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法，属于农业畜牧兽医应用领域。本发明专利技术的高通量筛选方法通过猪肝脏总RNA提取、RT-PCR得到的pgCAR基因片段与真核表达质粒连接和(NR1)5-TK?promotor全基片段与报告质粒连接，然后将重组表达质粒、重组报告质粒及内参报告质粒共转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株，再向稳定细胞株中加入待筛选的药物，测定报告基因的表达水平，评估药物的生物活性，将生物活性高的药物选出，得到pgCAR激动剂。本发明专利技术所建立的细胞筛选模型操作简单易行，具有很好的特异性和敏感性，能够高效、快速、准确地发现猪CAR的激动剂。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术属于农业畜牧兽医应用领域，具体地说是一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法。
技术介绍
核受体(nuclear receptor)是一类配体依赖的转录因子，启动细胞内信号转导的级联反应。核受体与相应的配体及其辅调节因子相互作用，调控基因的协调表达，从而在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化及体内许多生理过程中发挥重要作用。核受体调控基因表达的典型模式是结合配体，引起受体结构的变化，允许和辅助因子作用，从而调控基因的表达。与典型模式不同的是，CAR在没有配体信号情况下能够调控与类固醇、药物、异型生物质代谢相关基因的转录。CAR与RXR(类维生素A-X-受体)相连后想成一种异质二聚体，并能识别在第Ι、Π、ΙΙΙ阶段的酶和转录蛋白的5'调控区的特定的六个碱基的DNA序列。又很少的化合物可以与CAR的配体结合区相结合，进行基因转录调控。鼠类CAR激动剂已选出几种，但在人类的CAR激动剂研究中，筛选出的激动剂很少，并且两物种选出的激动剂有所不同。见于CAR对药物、膻味物质等异型生物质代谢基因的作用，因此猪CAR基因的表达对改善肉质等性能有重要的意义。而且，关于猪CAR激动剂的筛选还未见文献报道。研究基因表达水平的方法很多，如Western blot、毛细管电泳、基因芯片、mRNA差异显示等。这些经典的方法虽然直接，但是除了毛细管电泳有望开发成高通量筛选方法外，其他都不行，且毛细管电泳用于高通量药物筛选还很不成熟。报告基因方法也常用于研究基因表达和调控，可以从基因转录和翻译两个水平去研究。在翻译水平上不太容易设计成高通量药物筛选方法，而且翻泽水平又受到转录水平的控制。因此，我们认为从转录水平来考虑是比较理想的，通过提高转录水平，就可能达到提高基因表达的目的。 从转录水平研究基因表的的报告基因方法，快速、灵敏，适合高通量药物筛选。因此通过建立基于猪核受体CAR激动剂的筛选模型，对一系列生物活性物质的CAR激动活性进行筛选， 以期研究开发出一种CAR激动剂类减少异型生物质的生物活性物质，对促进猪只健康和保障猪肉安全具有重要的理论与现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种灵敏、高效、规模大、能适用于pgCAR激动剂的高通量筛选方法。具体来说本专利技术是通过以下技术方案来达到本专利技术目的，主要包括以下几个步骤第一步猪肝脏总RNA提取，RT-PCR扩增出pgCAR基因片段将冻存于液氮中的猪肝脏组织在始终有液氮存在的研钵中进行研磨，将研磨成粉末状的肝脏组织进行总RNA提取，总RNA提取试剂盒购自Bioteke公司；将提取出的总RNA进行反转录，反转录试剂盒购自Applied Biosystems公司，形成cDNA ；根据pgCAR的序列设计两段引物上游5，-CCCAAG CTT GCC ATG GCC AGC GGG GAA GA-3，，下游:5，-CGCGGA TCC TCA GCT GCA GAT CTC CTG GA-3，，将其稀释到20 μ M ；以反转录后的cDNA为模板进行目的基因的扩增，总体积为 25 μ 1，PCR体系为权利要求1. 一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法，其特征在于，方法如下 第一步猪肝脏总RNA提取，RT-PCR扩增出pgCAR基因片段 将冻存于液氮中的猪肝脏组织在始终有液氮存在的研钵中进行研磨，将研磨成粉末状的肝脏组织进行总RNA提取，总RNA提取试剂盒购自Bioteke公司；将提取出的总RNA进行反转录，反转录试剂盒购自Applied Biosystems公司，形成 cDNA ；根据pgCAR的序列设计两段引物上游:5，-CCC AAG CTT GCC ATG GCC AGC GGG GAA GA-3，， 下游:5，-CGC GGA TCC TCA GCT GCA GAT CTC CTG GA-3，，将其稀释到20 μ M ；以反转录后的cDNA为模板进行目的基因的扩增，总体积为25 μ 1， PCR体系为全文摘要本项专利技术涉及一种猪CAR激动剂的高通量筛选方法，属于农业畜牧兽医应用领域。本专利技术的高通量筛选方法通过猪肝脏总RNA提取、RT-PCR得到的pgCAR基因片段与真核表达质粒连接和(NR1)5-TK promotor全基片段与报告质粒连接，然后将重组表达质粒、重组报告质粒及内参报告质粒共转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株，再向稳定细胞株中加入待筛选的药物，测定报告基因的表达水平，评估药物的生物活性，将生物活性高的药物选出，得到pgCAR激动剂。本专利技术所建立的细胞筛选模型操作简单易行，具有很好的特异性和敏感性，能够高效、快速、准确地发现猪CAR的激动剂。文档编号G01N21/64GK102321732SQ201110221908公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年6月20日专利技术者单安山, 娄蕾, 石宝明 申请人:东北农业大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪ＣＡＲ激动剂的高通量筛选方法，其特征在于，方法如下：第一步：猪肝脏总ＲＮＡ提取，ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ｐｇＣＡＲ基因片段：将冻存于液氮中的猪肝脏组织在始终有液氮存在的研钵中进行研磨，将研磨成粉末状的肝脏组织进行总ＲＮＡ提取，总ＲＮＡ提取试剂盒购自Ｂｉｏｔｅｋｅ公司；将提取出的总ＲＮＡ进行反转录，反转录试剂盒购自Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司，形成ｃＤＮＡ；根据ｐｇＣＡＲ的序列设计两段引物：上游：５’－ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＧＡ－３’，下游：５’－ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＧＡ－３’，将其稀释到２０μＭ；以反转录后的ｃＤＮＡ为模板进行目的基因的扩增，总体积为２５μｌ，ＰＣＲ体系为：扩增酶购自ＴａＫａＲａ公司，将ＰＣＲ产物克隆到购自ＴａＫａＲａ公司的载体ｐＭＤ１８－Ｔ中，形成质粒Ｔ－ＣＡＲ进行测序；测序结果显示扩增出的ｐｇＣＡＲ序列为：ａｔｇｇｃｃａｇｃｇ　ｇｇｇａａｇａｔｇａ　ｇｃｃａａｇｇａａｃ　ｔｇｔｇｃｔｇｔｇｔ　ｇｃｇｇｇｇａｃｃｇ　ａｇｃｃａｃａｇｇｃｔａｔｃａｃｔｔｃｃ　ａｔｇｃｃｔｔｇａｃ　ｔｔｇｔｇａｇｇｇｃ　ｔｇｃａａｇｇｇｔｔ　ｔｃｔｔｃａｇｇｃｇ　ａａｃａｇｔｃａａｃａａａａｇｃａｃｃａ　ｇｔｃｔｃａｔｃｔｇ　ｃｃｃｃｔｔｔｇｃｔ　ｇｇａａｇｃｔｇｔａａｇｇｔｃａａｔａａ　ｇｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｃｃａｃｔｇｃｃ　ｃａｇｃｃｔｇｃａｇ　ｇｔｔｇｃａｇａａｇ　ｔｇｃｃｔａｇａｔｇ　ｃｔｇｇｃａｔｇａａ　ｇａａａｇａｃａｔｇａｔｃｃｔａｔｃａｇ　ｃａｇａａｇｔｃｃｔ　ｇｇｃａｔｔｇｃｇｇｃｇａｇｃａａｇａｃ　ａｇｇｔｔｃａｇｃｇ　ｃｃｇｇｇｃａｃａｇｃａａｇｃａｔｃａｃ　ｔｇｃａｇｃｔｇａｇ　ｔａａｇｇａｇｃａｇ　ａａｇｇｃｇｔｔａｇ　ｔｃｃａｇａｔａｃｔ　ｃｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｔａｃｃｃｇｃｃ　ａｔａｔｇｇｇｃａｃ　ｔａｔｇｔｔｔｇａｔ　ｃａｇｔｔｔｇｔｇｃ　ａｇｔｔｃａｇｇｃｃ　ｔｃｃａｇｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｃａｔｃｃ　ａｔｃａｃｃａｇｃａ　ｃｔｔｇｃｃａｃｃｃ　ｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇ　ａａｃｔｇｔｃｔｃｔ　ｇｃｔｃａｔｇｃａｔｔｔｃｇｃｇｇａｃａ　ｔｃａａｃａｃｔｔｔ　ｃａｔｇａｔａｃａｇ　ｃａａａｔｔａｔｃａ　ａｇｔｔｃａｃｃａａ　ｇｇａｔｃｔｇｃｃｃｃｔｃｔｔｃｃｇｇｔ　ｃｃｃｔｇｃｃｃａｔ　ｇｇａｇｇａｃｃａｇ　ａｔｃｔｃｃｃｔｔｃ　ｔｃａａｇｇｇａｇｃ　ａｇｃｔｇｔａｇａａａｔｔｔｇｔｃａｇａ　ｔｃｇｔａｃｔｃａａ　ｔａｃｃａｃｔｔｔｃ　ｔｇｔｃｔｇｃａａａ　ｃａｃａａａａａｔｔ　ｃｃｔｃｔｇｔｇｇｇｃｃｔｃｔｔｃｇｃｔ　ａｃａｃａａｔａｇａ　ａｇａｔｇｇａｇｃｇ　ｃａｔｇｔｇｇｇｇｔ　ｔｃｃａｇｇａａｇａ　ｇｔｔｔｔｔｇｇａｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｇ　ｇｃｔｔｃｃａｔａａ　ｇａｃａｃｔｔｃｇｇ　ｃｇａｃｔｇｃａｇｃ　ｔｃｃａｇｇａｇｃｃ　ｔｇａｇｔａｔｇｔｇｃｔｃａｔｇｇｔｔｇ　ｃｔｇｔｇｇｃｃｃｔ　ｃｔｔｃｔｃｔｃｃｔ　ｇａｃｃｇｇｃｃｔｇ　ｇｇｇｔａａｃｃｃａ　ｇａｇｇａａｇｇａｇａｔｔｇａｔｃａｇｔ　ｔｇｃａａｇａｇｇａ　ｇａｔｇｇｃａｃｔｇ　ａｃｔｃｔｇｃａｇａ　ｇｃｔａｃａｔｃａａ　ａｇｇｇｃａｇｃａｇｃｃａａｇｔｃｔｃｃ　ｇｇｇａｃａｇｇｔｔ　ｔｃｔｃｔａｔｇｃａ　ａａｇｃｔｇｃｔｇｇ　ｇｃｃｔａｔｔｇｇｃ　ｔｇａｇｃｔｃｃｇａａｇｃａｔｔａａｃａ　ａａｇａａｔａｃｔｇ　ｇｔａｃｃａａａｔｃ　ｃａｇａａｃａｔｃｃ　ａｇｇｇａｃｔｇｔｃ　ｃａｃｃａｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｇｃｔｃｃ　ａｇｇａｇａｔｃｔｇ　ｃａｇｃｔｇａ第二步：将ｐｇＣＡＲ基因片段与真核表达质粒连接：通过Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ和购自ＴａＫａＲａ公司的ＢａｍＨ　Ｉ酶双酶切Ｔ－ＣＡＲ质粒得到ｐｇＣＡＲ目的片段，再亚克隆到用Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ和ＢａｍＨ　Ｉ酶双酶切过的（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达质粒上，连接酶购自ＴａＫａＲａ公司，最终构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＣＡＲ重组表达质粒；第三步：ＮＲ１响应元件五联体和（ＮＲ１）５－ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｏｒ全基因合成，并与报告质粒连接：（ＮＲ１）５－ＴＫ全基因序列为：ａｇａｔｃｔｇａｔｃ　ａｃｔｇｔａｃｔｔｔ　ｃｃｔｇａｃｃｔｔｇ　ｇａｔｃｇａｔｃａｃ　ｔｇｔａｃｔｔｔｃｃ　ｔｇａｃｃｔｔｇｇａｔｃｇａｔｃａｃｔｇ　ｔａｃｔｔｔｃｃｔｇ　ａｃｃｔｔｇｇａｔｃ　ｇａｔｃａｃｔｇｔａ　ｃｔｔｔｃｃｔｇａｃｃｔｔｇｇａｔｃｇａｔｃａｃｔｇｔａｃｔ　ｔｔｃｃｔｇａｃｃｔ　ｔｇｇａｔｃｇｇｃｃ　ｃｃｇｃｃｃａｇｃｇ　ｔｃｔｔｇｔｃａｔｔ　ｇｇｃｇａａｔｔｃｇａａｃａｃｇｃａ...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：石宝明，娄蕾，单安山，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93