一种非小细胞肺癌标志物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种非小细胞肺癌肿瘤标志物，属于生物技术领域，该标志物为STAT3，还可以包括CEA、CA125和CYFRA21-1，证实了STAT3在外周血和血清中的高表达，并公开了STAT3在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用发明专利技术人利用，并利用基因重组技术，针对STAT3基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体PSUPER-STAT3构建成功；并将其成功转染入真核细胞中，为进一步深入关于肺癌RNAi的实验研究及抗肿瘤的基因治疗奠定了基础；运用RNAi技术，可以有效地抑制STAT3的基因表达，诱导细胞凋亡，为肺癌的分子机制研究和基因治疗奠定基础，提供了制备相关靶向药物的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种肿瘤标志物及其应用。
技术介绍
肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，被认为是癌症中的第一杀手。目前我国肺癌的 5年生存率仅10%，只有15%的患者在确诊时病变局限，而大部分确诊时已失去手术机会， 因此预后极差，病死率极高。肺癌的高病死率主要原因是由于无法做到早期诊断所致，因此，早期诊断肺癌是不失时机、及时规范治疗并改善其预后的最有效措施。目前影像学和纤维支气管镜检查是诊断肺癌的主要手段，与两者相比，肿瘤标志物检测具有简便、费用相对低、没有射线危害、风险小、病人容易接受等优点。在临床上肿瘤标志物已成为肿瘤患者早期发现的重要检查指标之一。不但能提高早期诊断率，还对肺癌的治疗效果及预后判断起着重要指导作用。目前，常见的肿瘤标志物如CEA、CA125和CYFRA21-1等，被单独用于检测肿瘤包括非小细胞肺癌细胞或者联合应用， 但是其特异性、敏感性有待进一步提高。因此，寻找更多特异性敏感性更高的肺癌标志物，对目前诊断和治疗肺癌都有重大意义，已成为肺癌防治的当务之急。STAT3是在1994年作为白细胞介素-6 (IL-6)信号传递中的急性期反应因子 (APRF)被纯化的，是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道耦联的双功能蛋白，广泛表达于不同类型的细胞和组织中。编码STAT3的基因在人类定位于第12号染色体(ql3至 ql4_l)。在正常情况下，STAT3信号途径的激活是一个瞬时的过程，并受严密调控，参与细胞的增殖、分化及凋亡等，其持续激活却可致细胞异常增殖和恶性转化，阻止细胞凋亡，参与人类恶性肿瘤的发生发展和演进全过程。近年来发现STAT3在多种恶性肿瘤组织与细胞系中均有异常表达和活性增强。但STAT3其在肺癌患者尤其是非小细胞肺癌患者的组织及血液中的表达情况，及作为一种新的肺癌诊断的标志物可行性，以及其相关应用，目前尚无文献报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的之一在于针对上述存在的问题，提供新的非小细胞肺癌诊断标志物。本专利技术采用的技术方案是这样的该标志物为STAT3。进一步的该标志物还包括CEA、CA125和CYFRA21-1，即采用STAT3与CEA、CA125 和CYFRA21-1作为标志物物四项联检。专利技术人主要通过以下的实验研究，为上述内容进行了充分的证明采用免疫组化、荧光定量PCR等方法测定人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC -5 中STAT3、CEA、CA125蛋白和mRNA的表达，同时对STAT3分别与CEA、CA125的相关性进行比较。免疫组织化学染色图像分析结果提示STAT3蛋白、CEA蛋白、CA125蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于它们各自在正常人胚肺细胞MRC-5中的表达，它们各自在两组细胞中的表达差异有显著统计学意义。STAT3蛋白与CEA蛋白及CA125蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达呈正相关。荧光定量PCR技术结果显示STAT3、CEA、CA125和GAPDH 扩增产物特异；扩增效率分别为96. 97%,98. 71%,95. 17和％ 96. 76%。STAT3 mRNA.CEA mRNA、CA125 mRNA在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于它们各自在正常人胚肺细胞MRC-5中的表达，经统计学分析，它们各自在两组细胞中的表达差异具有统计学意义。STAT3 mRNA与CEA mRNA及CA125 mRNA在人肺腺癌细胞A549中的表达呈正相关。本专利技术的专利技术目的之二在于提供STAT3作为非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。作为优选所述诊断试剂为试剂盒。进一步的所述试剂盒包括以常规方法特异性扩增SATA3基因或转录本的引物； 或/和特异性识别STAT3基因或转录本的探针； 或特异性结合STAT3蛋白的抗体或配体。更进一步的所述试剂盒还包括 DNA提取试剂；或/和其他聚合酶链反应(PCR)试剂； 或酶联免疫检测(如ELISE)试剂。专利技术人主要通过以下的实验研究，为上述内容进行了充分的证明利用Real-Time PCR、酶联免疫吸附(Elise)等方法，分别检测了在肺癌及其配对的正常组外周血中STAT3的mRNA表达水平，及外周血清中STAT3、CEA、CA125及CYFRA21-1蛋白的表达。发现STAT3的mRNA和蛋白在外周血中都有较高水平的表达，且与肺癌的病理类型及分化程度有密切相关性，与有无淋巴结转移无相关。分析STAT3的表达和患者的临床特征之间的相关性表明，STAT3参与了肺癌的发生和发展的过程。本实验还提示STAT3蛋白与CEA、CA125、CYFRA21-1对非小细胞肺癌具有相同的诊断价值，准确性无明显差异。应用 STAT3+CEA+CA125+CYFRA21-1四项联检准确性明显高于CEA+CA125+CYFRA21-1三项联检， 达到较高的诊断价值。本专利技术的专利技术目的之三在于提供STAT3作为小细胞肺癌标志物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。作为优选所述治疗非小细胞肺癌的药物为采用RNA干扰技术制得的 siRNA-STAT3。进一步的所述siRNA_STAT3的核苷酸序列为5 ’ -GATCCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTA-3’。专利技术人利用基因重组技术，针对STAT3基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体PSUPER-STAT3构建成功；并将其成功转染入真核细胞中，为进一步深入关于肺癌RNAi的实验研究及抗肿瘤的基因治疗奠定了基础。利用A549 细胞株，在分子水平上，体内转录产生的针对STAT3基因的siRNA可抑制A549细胞的STAT3 mRNA的表达，并抑制A549细胞的生长，促进其凋亡。运用RNAi技术，可以有效地抑制STAT3的基因表达，诱导细胞凋亡，为肺癌的分子机制研究和基因治疗奠定基础，提供了制备相关靶向药物的应用。附图说明图1是STAT3蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图2是STAT3蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)；图3是CEA蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图4是CEA蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)； 图5是CA125蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图6是CA125蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)； 图7是STAT3、CEA、CA125蛋白在A549和MRC-5细胞中的表达(i 士 s)； 图8-1是STAT3基因的熔解曲线； 图8-2是CEA基因的熔解曲线； 图8-3是CA125基因的熔解曲线； 图8-4是GAPDH基因的熔解曲线； 图9-1是STAT3基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-2是CEA基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-3是CA125基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-4是GAPDH基因的扩增曲线和标准曲线；图 10 是 STAT3 mRNA、CEA mRNA、CA125mRNA 在 A549 和 MRC-5 细胞中的表达( 士 s)；图11-1是STAT3的Real-time PCR的扩增曲线；图11-2是STAT3本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种非小细胞肺癌标志物，该标志物为ＳＴＡＴ３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿程，宋本艳，蓝秀，王超，辛彩霞，王传辉，
申请(专利权)人：泸州医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：51