本发明专利技术属于氨基酸检测技术领域，具体为奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法。解决现有的氨基酸测定方法存在成本高、普适性差以及目前基于高效液相色谱仪不能快速准确对蛋白水解后的18种标准氨基酸进行定性和定量分析的问题。本方法通过三种不同的水解方法对奶粉进行前处理，通过CNBF衍生剂对奶粉水解样品进行柱前衍生，采用HPLC和通用的C18（250mm×4.6mm，5μm）液相色谱柱，并对衍生条件和色谱分离检测条件进行优化，能够对奶粉中蛋白水解的全部18种氨基酸进行分离和测定，该方法普适性更强，而且不需要贵重的氨基酸分析仪和/或贵重的氨基酸测定试剂包，适用于更多的常规实验室。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于氨基酸检测
，具体为。
技术介绍
近年来，乳制品食品安全事件引起社会广泛关注，由于乳制品引发的食源性疾病明显增多，使得乳制品的质量安全问题受到广泛重视。食品科技的发展在丰富人类食品消费的同时，也给乳制品生产带来了安全问题。为了加强乳制品质量监管，《食品安全法》、《乳品质量安全监督管理条例》、《2010版企业生产乳制品许可条件审查细则》、《2010版企业生产婴幼儿配方奶粉许可条件审查细则》等法规相继出台，乳制品行业迫切需要更多的整体解决方案以满足日益增加的检测需求。众多的检测需求以及法规需求，同时也给乳制品分析实验室带来了如何提高实验室效率和降低分析成本的难题。针对氨基酸检测，现有的氨基酸测定方法，多数使用茚三酮染色或衍生，采用分光光度计或氨基酸分析仪进行氨基酸的分析，也有部分采用高效液相色谱仪，但也需要使用特殊的离子交换色谱柱。现行国家标准GB/T 5009. 1M-2003《食品中氨基酸的测定》用于测定食品中16种氨基酸(不包括色氨酸和(半)胱氨酸)，GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》能够测定全部18种水解氨基酸，但二者均采用全自动氨基酸分析仪； IS013903 2005 (E)《动物饲料-氨基酸含量的测定》使用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪测定动物饲料中的17种氨基酸(不包括色氨酸，不能区分胱氨酸和半胱氨酸)；AOAC官方方法994. 12《饲料中氨基酸-过甲酸氧化与偏亚硫酸氢钠-酸水解法》适用于用氨基酸分析仪测定16种氨基酸(包括蛋氨酸和胱氨酸，不包括酪氨酸和色氨酸)。采用高效液相色谱仪检测氨基酸时，由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测的灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行柱前或柱后衍生，柱前衍生通常采用邻苯二甲醛(ΟΡΑ)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、丹酰氯 (DANSYL-C1)、2，4 -二硝基氟苯(DNFB)、氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC) 等，柱后衍生应用最广泛的是茚三酮，然而上述衍生试剂各有优劣。目前备受关注的衍生剂 4-氯-3，5- 二硝基三氟甲基苯(CNBF)，石天玉等(2009)使用CNBF衍生剂和柱前衍生法对 19种游离氨基酸(包括除谷氨酰胺(Gln)和精氨酸(Arg)的18种标准氨基酸)进行了测定， 是采用柱前衍生测定氨基酸含量的一种新的尝试。采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测法可不经过衍生对氨基酸进行测定。ELSD检测器是一种万能型检测器，不衍生即能够检测氨基酸和碳水化合物等物质， 检测的范围宽，使用较为方便。但该检测器对样品前处理要求比较严格，适用于成分比较单一或比较干净的样品的检测，成分复杂的样品则会对结果造成较大的干扰；在洗脱液雾化过程中需消耗大量的氮气，增加了测定成本；不能使用盐溶液作为流动相，会对检测造成干扰。因此，现有的氨基酸检测方法多数需采用分光光度计或者氨基酸自动分析仪，少数使用高效液相色谱仪也需特殊的离子交换色谱柱或者ELSD检测器或者氨基酸测定试剂包，不具有普遍实用性，成本也比较高，目前基于高效液相色谱仪的氨基酸测定方法并不能快速准确对蛋白水解后的18种标准氨基酸进行定性和定量分析。
技术实现思路
本专利技术为解决现有的氨基酸测定方法存在成本高、普适性差以及基于高效液相色谱仪的氨基酸测定方法不能满足快速准确地对18种蛋白水解标准氨基酸进行定性和定量分析的问题，提供。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，包括以下步骤(1)制备奶粉水解样品采用三种不同的前处理方法即常规水解法、氧化水解法、碱水解法分别对奶粉进行水解，分别制得三种奶粉水解样品；(通过不同的前处理分离和测定18种蛋白水解氨基酸，其中常规(酸)水解法适用于分离和测定除含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)和色氨酸以外的水解氨基酸，包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸15种氨基酸；氧化(酸)水解法适用于分离和测定蛋氨酸和半胱氨酸两种含硫氨基酸；碱水解法适用于分离和测定色氨酸。对于本领域普通技术人员而言，上述三种不同的水解方法是容易实现的。)(2)三种奶粉水解样品的衍生衍生剂为4-氯-3，5-二硝基三氟甲基苯(CNBF)，其浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，衍生时间为40min，衍生温度为65°C，同时以上述衍生条件对18种混合氨基酸标准溶液进行衍生；(所述的衍生剂4-氯-3，5- 二硝基三氟甲基苯即CNBF，能与一级或二级氨基酸反应生成既具有强的紫外吸收、又具有荧光吸收的稳定产物。该衍生剂反应条件温和，与氨基酸反应生成稳定的N-代-2，6- 二硝基-4-三氟甲基-苯胺，衍生产物在室温下稳定保存3天以上，在MOnm能够将18种氨基酸的波峰充分分离，而有利于进行准确有效的检测。CNBF的浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，理论上讲有多种可能，然而还要考虑到费用问题，尽可能做到经济高效。过量的CNBF衍生剂与水反应生成不干扰测定的稳定的副产物4-氨-3，5- 二硝基氟苯和3，5- 二硝基对三氟苯酚。该衍生剂的特点和优势有利于准确有效的氨基酸测定，作为一种精细化工原料，价格便宜，容易购得，有利于方法的推广应用。)(3)色谱分离检测条件检测仪器Waters Alliance 2690Λ695高效液相色谱系统，120孔自动进样装置， Waters M87紫外检测器，Waters 二极管阵列检测器(PDA)(用于对CNBF氨基酸衍生物的吸收波长的紫外扫描和氨基酸的定性)；色谱柱通用的C18 (250 mm X 4. 6 mm, 5 μ m)液相色谱柱； 流动相流动相A为乙腈，流动相B为50mmol/L乙酸钠缓冲液与0. 24%的三乙胺，流速为 0. 32ml/min, pH 为 5. 8 ；检测波长设定吸收波长为240nm ； (4)测定对衍生后的18种混合氨基酸标准溶液进行紫外光谱扫描和色谱检测，得到18种标准氨基酸CNBF衍生物光谱扫描图和色谱图；对衍生后的三种不同前处理的奶粉水解样品进行高效液相色谱分析，得到奶粉中18种氨基酸HPLC测定曲线图谱。本方法通过三种不同的水解方法对奶粉进行前处理，采用HPLC和通用的C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m)液相色谱柱，能够对奶粉中蛋白水解的全部18种氨基酸进行分离和测定，该方法普适性更强，而且不需要贵重的氨基酸分析仪和/或贵重的氨基酸测定试剂包，适用于更多的常规实验室。附图说明图1为18种标准氨基酸CNBF衍生物的光谱扫描图2为浓度为2 mmol/ L的18种蛋白水解氨基酸CNBF衍生物色谱图； 图3为采用常规酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A;图4为采用常规酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱B;图5为采用氧化酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A;图6为采用氧化酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱B;图7为采用碱水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A ； 图8为采用碱本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．奶粉中１８种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（１）制备奶粉水解样品：采用三种不同的前处理方法即常规水解法、氧化水解法、碱水解法分别对奶粉进行水解，分别制得奶粉水解样品；（２）三种奶粉水解样品的衍生：衍生剂为ＣＮＢＦ，其浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的３倍，衍生时间为４０ｍｉｎ，衍生温度为６５℃，同时以上述衍生条件对１８种混合氨基酸标准溶液进行衍生；（３）色谱分离检测条件：检测仪器：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０／２６９５高效液相色谱系统，１２０孔自动进样装置，Ｗａｔｅｒｓ ２４８７紫外检测器，Ｗａｔｅｒｓ二极管阵列检测器；色谱柱：通用的Ｃ１８液相色谱柱；流动相：流动相Ａ为乙腈，流动相Ｂ为５０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸钠缓冲液与０．２４％的三乙胺，流速为０．３２ｍｌ／ｍｉｎ，ｐＨ为５．８；检测波长：设定吸收波长为２４０ｎｍ；（４）测定：对衍生后的１８种混合氨基酸标准溶液进行紫外光谱扫描和色谱检测，得到１８种标准氨基酸衍生物光谱扫描图和色谱图；对衍生后的三种不同前处理的奶粉水解样品进行高效液相色谱分析，得到奶粉中１８种氨基酸ＨＰＬＣ测定曲线图谱。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李卫华，傅英文，宋欢，李玉玲，张建军，
申请(专利权)人：山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：14
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