本发明专利技术公开了一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒，步骤以下包括：(1)将生物细胞裂解释放出DNA；(2)将含有生物DNA的溶液和能够与DNA结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹γ-Fe2O3纳米颗粒，在异丙醇的作用下，DNA结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下收集磁性纳米颗粒，即为结合了DNA的磁性纳米颗粒；(3)加水，磁性分离收集水溶液，即得到分离的生物的DNA溶液；(4)以DNA溶液为模板，利用目标生物的特异性引物进行PCR扩增。本发明专利技术整个检测过程所需的时间仅为2小时，对单增李斯特菌的检出限约为1CFU/25g(mL)，所需时间短，灵敏度高，结果可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体公开了一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒。
技术介绍
近年来，食源性致病菌快速检测技术正迅速发展，2009年2月在《中华人民共和国食品安全法》由十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议通过。食源性致病菌检测是对食品的原料及其生产加工、储藏等环境中的致病菌进行分离或者原位检测。食源性致病菌快速检测所用方法包括是免疫学、生物化学、生物物理等。单增李斯特菌是唯一公认能引起人类疾病的李斯特菌。它是一种常见的土壤细菌，当污染食物后也能引起严重食物中毒。作为一种人畜共患病的病原菌，能引起人、畜的感染，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多等。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，尤其在4°C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之ο对于单增李斯特菌的检测，我国有国家标准《GB 4789. 30-2010单核细胞增生李斯特氏菌检验》及出入境检验检疫行业标准《SN/T0184. 1-2005进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法》。现在广泛使用的致病菌检测方法主要有四种，都适用于单增李斯特菌的检测平皿培养分离计数法，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，荧光PCR检验方法与ELISA酶联免疫吸附试验。平皿培养分离鉴定法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方法对奶粉中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前最成熟，使用最广泛，作为基准的检验方法，但是存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。PCR聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。样品(经前处理增菌后)，提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否污染食源性致病菌进行快速检验。用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的假阳性和假阴性率。ELISA，即酶联免疫吸附试验，具有很高的灵敏性及可重复性，但每次只能检测一种标志物，不能满足多种被检物同时检测的需要，且ELISA方法成本操作繁琐，试剂盒价格昂贵，大量使用将产生很高的成本负担。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的生物检测方法检测过程繁琐，灵敏度不高的不足，提供一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒。本专利技术旨在提供一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案为一种高灵敏度快速检测生物种类的方法，步骤以下包括(1)将生物细胞裂解释放出DNA，得到含有该生物DNA的溶液；(2)将步骤(1)所得的含有生物DNA的溶液和能够与DNA结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹Y-Fe2O3纳米颗粒，在异丙醇的作用下， DNA结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，即为结合了 DNA的磁性纳米颗粒；(3)将步骤(2)收集所得的结合了 DNA的磁性纳米颗粒中加水，磁性分离，收集水溶液，即得到分离的生物的DNA溶液；(4)以步骤(3)得到的DNA溶液为模板，利用目标生物的特异性引物，进行PCR扩+曰O步骤(1)中裂解生物细胞的方法是普通的常规细胞裂解法。较佳的，可以是热裂解法，将生物样品在水中煮沸，即细胞裂解，释放出DNA。步骤O)中可以采用现有的各种能够与DNA结合的磁性纳米颗粒，较佳的是羧基修饰的氨基二氧化硅包裹Y-Fe2O3纳米颗粒，更佳的是由本专利技术所述方法制备的。在DNA 水溶液中加入该磁性纳米颗粒和异丙醇，即可使DNA结合到磁性纳米颗粒表面，从而通过磁性分离出该结合DNA的磁性纳米颗粒。异丙醇加入量较佳的为水相溶液体积的19倍，在这种情况下DNA吸附于磁性纳米颗粒表面。步骤C3)中加入水即使DNA从磁性纳米颗粒表面脱落，溶解于水中，从而经过磁性分离得到DNA溶液。步骤中采用现有的任何生物的特异性引物为引物，来特异性扩增目标DNA片段。较佳的，例如采用李斯特菌的特异性引物来进行扩增，从而检测DNA溶液中是否含有李斯特菌的DNA。在得到扩增产物的情况下，则待测的生物中含有李斯特菌，是阳性结果。在没有得到扩增产物的情况下，则待测的生物中不含有李斯特菌，是阴性结果。本方法可以同时设立阳性对照、阴性对照或者空白对照。所述特异性引物优选Hly和lap。PCR扩增条件优选:95V Imin ；95°C 30s, 58. 7V 20s,72°C 20s, 30 个循环；72°C 5min ；4°C保存。Hly CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT,lap :GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。本专利技术的一优选方案为一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤(1)将待测样品置于离心管，10000r/min离心lmin，弃去上清液；用灭菌的去离子水离心洗涤，去除杂质；用灭菌的去离子水悬浮沉淀物，将悬浮液于沸水浴中煮沸lOmin， 10000r/min离心lmin，使样品中生物细胞裂解，释放出DNA，取其上清液；(2)取步骤(1)所得的上清液于离心管中，向其中加入本专利技术所述的特异性结合 DNA的磁性纳米颗粒和异丙醇，异丙醇加入量为水相溶液体积的19倍，在这种情况下DNA吸附于磁性纳米颗粒表面；(3)在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，用98%乙醇洗涤去杂质，加入去离子水，在外加磁场作用下，收集洗脱液，用特定条件PCR检验单增李斯特菌。所述的特异性结合DNA的磁性纳米颗粒较佳的是以四氧化三铁纳米粒子为内核， 以二氧化硅为外壳，表面修饰羧基。所述PCR扩增所用引物优选Hly :CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT ；lap :GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。所述PCR 扩增程序为95°C Imin ；95 °C 30s, 58. 7 °C 20s, 72 °C 20s, 30 个循环； 72 °C 5min ；4°C 保存。所述PCR 扩增的体系为10 X PCR Buffer (2. 5 μ 1), Blend Taq-Plus (0· 5 μ 1)，模板(2.0 μ 1)，引物(共 8.0 μ 1)，dNTPs (2. 0 μ 1)，ddH20(10. 0μ 1)。步骤⑵和(3)所述的外加磁场为1000 5000 。本专利技术所述的特异性结合DNA的磁性纳米颗粒的制备方法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高灵敏度快速检测生物种类的方法，其特征在于，步骤以下包括：（１）将生物细胞裂解释放出ＤＮＡ，得到含有该生物ＤＮＡ的溶液；（２）将步骤（１）所得的含有生物ＤＮＡ的溶液和能够与ＤＮＡ结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹γ－Ｆｅ２Ｏ３纳米颗粒，在异丙醇的作用下，ＤＮＡ结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，即为结合了ＤＮＡ的磁性纳米颗粒；（３）将步骤（２）收集所得的结合了ＤＮＡ的磁性纳米颗粒中加水，磁性分离，收集水溶液，即得到分离的生物的ＤＮＡ溶液；（４）以步骤（３）得到的ＤＮＡ溶液为模板，利用目标生物的特异性引物，进行ＰＣＲ扩增。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟瑾，郑小平，韩奕奕，支援，李敏，
申请(专利权)人：上海德诺产品检测有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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