本发明专利技术涉及检测鸭瘟病毒抗体的gG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法与应用，该抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其制备方法包括：鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得、重组原核表达质粒pET32a-gG的获得、鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得三步骤；其可作为制备鸭瘟病毒抗原及亚单位疫苗运用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别涉及检测鸭瘟病毒抗体的gG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法。
技术介绍
鸭瘟(DuckPlague, DP)，又名鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis, DVE)，是由鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)引起鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、败血性传染病。鸭瘟的临床症状为精神沉郁、高热稽留、共济失调、下痢、畏光流泪和部分病鸭头颈肿大，该病为一种嗜全身性感染的传染病，以急性败血症为主要特征。其病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。该病的流行特征是传播迅速、发病率和死亡率高，且对鸭、鹅和白天鹅易感，是水禽养殖业的一大危害。过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4 5d，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。
技术实现思路
专利技术的目的之一在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，该方法适用于大规模生产。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤 A鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得以鸭瘟病毒毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，得鸭瘟病毒gG基因片段， 与PMD18-T的连接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其上游引物如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； B重组原核表达质粒pET32a-gG的获得限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切pMD18_gG质粒和原核表达载体pET32a (+)， 以重组质粒为模板为模板，PCR扩增，得重组原核表达质粒pET32a-gG ； C鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得将步骤B所得重组原核表达质粒pET-32a-gG转化至表达菌株BL21 (DE3)进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。进一步，将步骤C所得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白进行亲和层析纯化，得纯化的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。进一步，将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a_gG转化至表达菌株BL21 (DE3)， 在IPTG浓度彡1. Ommol/L,诱导温度为25°C条件下进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。本专利技术的目的之二在于提供一种重组表达蛋白，该蛋白具有鸭瘟病毒免疫原性。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本专利技术的目的之三在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的两种应用，其为鸭瘟病毒的检测和治疗提供了新的思路。为实现上述目的，本专利技术的技术方案之一为所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。进一步，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的运用。本专利技术的另一技术方案为所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。本专利技术的目的之四在于提供一种鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，无需价格昂贵的仪器。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为运用所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括以下步骤A鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白稀释至终浓度为2. 5 μ g/100 μ L，在酶标板中包被过夜，用封闭液封闭，得固相抗原；B将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；C、将所述酶标二抗作2000倍体积稀释后，与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原一抗体一二抗复合物；D、在步骤c所得抗原一抗体一二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；E、将步骤d所述显色液用酶标仪测测OD45tlnm值，待检血清的OD45tlnm值>阴性样品OD45tlnm 值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD45tlnm值的均值，SD 为阴性样品OD45tlnm值的标准方差。本专利技术鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，是利用基因工程技术，鸭瘟病毒 (DPV)gG基因完整基因片段(自起始密码子ATG前3个碱基至终止密码杂子TAA)进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌B121(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是gG/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为70kDa，该蛋白设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。采用本专利技术的方法生产的产品可用于①本鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白可作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法的检测抗原。②可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。本专利技术的产品优点体现在①由于鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白并非全病毒，以此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。②作为ELISA抗原检测鸭瘟病毒抗体，特异性强，无交叉反应。 ③性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。附图说明图1为gG基因的琼脂糖凝胶电泳图；图中M为Marker，其中，I-A中，1为 gG基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；I-B中，1为重组质粒 pMD18-gG用BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带；I-C中，1为重组表达质粒pET32a-gG用Xho I单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的一条特异性条带，2为重组表达质粒pET32a-gG用BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。图2为鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，M为蛋白M arker ； 2-A中，1为空载体pET_32a (+)用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，2为空载体pET-32a (+)未用IPTG诱导，经SDS-PAGE电泳所得结果，3为重组表达质粒pET32a_gG 用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果，4为重组表达质粒pET32a_gG未用IPTG诱导，经 SDS-PAGE电泳所得结果，5为重组表达质粒pET32a-gG用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果，6为重组表达质粒pET32a-gG用IPTG 诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果；2-B中，1 为25°C诱导12h条件下，对重组质粒pET32a-gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为O mmol/L，2为25°C诱导12h条件下，对重组质粒pET32a_gG进行诱导表达，诱导剂IPTG的终浓度为0. 2 mmol/L，3为25°C诱导12本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．鸭瘟病毒ｇＧ基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：Ａ鸭瘟病毒ｇＧ的ＤＮＡ片段的获得以鸭瘟病毒毒株基因组ＤＮＡ为模板对ｇＧ基因进行ＰＣＲ扩增，得鸭瘟病毒 ｇＧ基因片段，与ｐＭＤ１８－Ｔ 的连接，得ｐＭＤ１８－ｇＧ，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示，其上游引物如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的核苷酸序列，下游引物如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的核苷酸序列；Ｂ 重组原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ｇＧ的获得限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ分别双酶切ｐＭＤ１８－ｇＧ质粒和原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋），并连接， 得重组原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ｇＧ； Ｃ 鸭瘟病毒ｇＧ基因重组原核表达蛋白的获得将步骤Ｂ所得重组原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ｇＧ转化至表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）进行诱导表达，得鸭瘟病毒ｇＧ基因重组原核表达蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，杨晓圆，汪铭书，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学实验动物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：51
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