一种荧光原位双杂交方法技术

本发明专利技术公开一种荧光原位双杂交方法，它对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片，通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及荧光原位杂交，特别涉及，属于生物医学领域。
技术介绍
荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH的基本原理是将DNA (或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA (或RNA)上，并用荧光素分子标记的单克隆抗体与探针分子特异性结合，来检测DNA序列在染色体或DNA (或RNA)上的定性、定位。国内外的荧光原位杂交应用主要在于临床方面，用来检验基因染色体位点变异，如慢性粒细胞白血病bcr/abl易位DNA探针和实体肿瘤检测的HER-2/neu基因探针。然而对组织中目的基因mRNA水平的定位及表达差异变化的研究方面应用甚少，目前缺乏一套稳定的体系来进行检测。在以往的FISH研究中，由于探针自身信号的强弱不同，杂交信号的显示存在不足。尽管采用的荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜对杂交结果进行观察，仍然不能很好地克服杂交信号显示不清楚的问题。在双标荧光原位杂交的方法的应用中，仍局限于临床染色体异常检测方面，如检测人精子染色体数目异常、检测星形细胞瘤染色体17pl3. 1 的丢失等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片后，该方法通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。本专利技术的技术方案是设计，其特征是它包括以下具体步骤是，其特征是它包括以下具体步骤是1)用含有H2A终浓度为m的摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室温， 10-15分钟；所述的H2A终浓度为m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氢二钠29. 0 克，磷酸二氢钠2. 9克，用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温，10-20 分钟；3)用含有TritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；4)50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；5)摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 -15分钟；6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1-2小时；7)在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和 FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60°C，各20-30分钟；9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，370C，20-30分钟；10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，37°C，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；11)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7. 5，摩尔浓度为0. 15 mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS:是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成；15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14) 中处理过的切片，室温，过夜；16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；所述的 TNT:是由TS7. 5和体积百分比为0. 05% Tween20配制而成；17)用摩尔浓度为0.1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；18)TSA-Biotin反应，放大杂交信号①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；19)用0.1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；20)在NaN3的终浓度为21的0.1 mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温， 10-15分钟；21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；24)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；25)用TNT洗涤步骤中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。所述的步骤4)中的50. 0 ml乙酰化液是由加入1 mol/L，pH值为8. 0的三乙醇胺 5.0 ml ；再加入最终体积百分比为0. 25%的纯冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述试剂的配制，能按比例扩大。所述的步骤7)中的杂交液是由以下5种试剂混合配成加入体积百分比为25% 的20 χ SSC ；再加入体积百分比为20%的浓度为10%的Blocking Reagent试剂；再加入体积百分比为50%的浓度为100%的去离子甲酰胺；再加入体积百分比为5%的浓度为1的 yV-Lauroylsarcosine溶液；再加入体积百分比为0. 1%的浓度为10%的SDS溶液；所述的20 X SSC为一种缓冲液；所述的SDS为十二烷基硫酸钠。所述的步骤8)中的洗涤液由以下3种试剂组成分别是终浓度为2 χ SSC，终体积百分比为50%的100%离子甲酰胺和终浓度为0. 1%的Kauroylsarcosine溶液；在配制洗涤液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。所述的步骤9)中的RNA缓冲液由以下3种试剂组成分别是终浓度为10 m mol/ L，pH值为8. 0的T本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种荧光原位双杂交方法，其特征是：它包括以下具体步骤是：１）用含有Ｈ２Ｏ２终浓度为２％的摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ的　ＤＥＰＣ－ＰＢ　孵育切片１次，室温，１０－１５分钟；所述的Ｈ２Ｏ２终浓度为２％　，所述的０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＤＥＰＣ－ＰＢ：是用磷酸氢二钠２９．０克，磷酸二氢钠２．９克，用超纯水定容至１Ｌ后，再加入体积百分比为０．１％的ＤＥＰＣ　１ｍｌ过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；２）用摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ的　ＤＥＰＣ－ＰＢ孵育步骤１）中处理过的切片１次，室温，１０－２０　分钟；３）用含有Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００终浓度为０．３％的摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ的　ＤＥＰＣ－ＰＢ孵育步骤２）中处理过的切片１次，室温，１０－１５分钟；所述的Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００　终浓度为０．３％；４）５０　ｍｌ的乙酰化液孵育步骤３）中处理过的切片１次，室温，１０－１５分钟；５）摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＤＥＰＣ－ＰＢ孵育步骤４）中处理过的切片２次，室温，各１０　－１５分钟；６）在杂交液中孵育步骤５）中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为６０℃，所需时间１－２小时；７）在杂交液中加入ＤＩＧ标记的探针，同时再加入ＦＩＴＣ标记的探针，ＤＩＧ标记的探针和ＦＩＴＣ标记的探针的终浓度为１ｕｇ／ｍｌ，　杂交过夜１６－２０小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；８）从步骤７）所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗２次，６０　℃，各２０－３０分钟；９）用ＲＮＡ缓冲液孵育步骤８）中处理过的切片１次，３７℃，２０－３０分钟；１０）用加入ＲＮＡ酶的ＲＮＡ缓冲液孵育步骤９）中处理过的切片，３７℃，３０－４０分钟；所述的ＲＮＡ酶终浓度为２０ｕｇ／ｍｌ；１１）用２　Ｘ　ＳＳＣ孵育步骤１０）　中处理过的切片２次，　３７℃，各２０－３０分钟；１２）用０．２ｘ　ＳＳＣ孵育步骤１１）中处理过的切片２次，　３７℃，各２０－３０分钟；１３）用ＴＳ７．５孵育步骤１２）中处理过的切片１次，室温，５－１０分钟；所述的ＴＳ７．５是由摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ　／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，　ＰＨ　７．５，　摩尔浓度为　０．１５　　ｍｏｌ　／Ｌ　ＮａＣｌ溶液用超纯水配制而成；１４）用ＴＢＳ封闭将步骤１３）中处理过的片子封闭，室温孵育１－２小时；所述的ＴＢＳ：　是由ＴＳ７．５和体积百分比为１％的Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ配制而成；１５）按１：２００的抗体效价，在ＴＢＳ溶液中加入抗Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ＰＯＤ孵育步骤１４）中处理过的切片，室温，过夜；１６）用ＴＮＴ于室温洗涤步骤１５）中处理过的切片２次，室温，各１０－１５分钟；　所述的ＴＮＴ：　是由　ＴＳ７．５和体积百分比为０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０配制而成；１７）用摩尔浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ　的ＰＢ洗涤步骤１６）中处理过的切片１次，室温，１０－１５分钟；１８）ＴＳＡ－Ｂｉｏｔｉｎ　反应，放大杂交信号：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　将步骤１７）中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育１０－１５分钟；　　　在上述反应液中加入５０ｕｌ的浓度为２００ｍｇ／ｍｌ　？－Ｄ葡萄糖，于室温孵育３０分钟；１９）用０．１　ｍｏｌ　／Ｌ　的ＰＢ洗涤步骤１８）中处理过的切片，室温，１０－２０分钟；２０）在ＮａＮ３的终浓度为２％的０．１　ｍｏｌ／Ｌ的　ＰＢ中孵育步骤１９）　处理过的切片，室温，１０－１５分钟；２１）用ＴＮＴ洗涤步骤２０）中处理过的切片２次，室温，各１０－１５分钟；２２）按１：２０００的抗体效价，用ＴＢＳ稀释Ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＰＯＤ抗体，室温孵育步骤２１）中处理过的切片，过夜；２３）用ＴＮＴ洗涤步骤２２）中处理过的切片２次，室温，各１０－１５分钟；２４）　ＴＳＡ－ＤＮＰ反应：根据试剂盒的说明书操作，按照１：５０比例将ＴＳＡ－ＤＮＰ稀释后孵育步骤２３）中处理过的切片；２５）用ＴＮＴ洗涤步骤２４）中处理过的切片２次，室温，各１０－１５分钟；２６）用ＴＮＴ按照２种荧光抗体：Ａｌｅｘａ４８８－ＤＮＰ和Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　－　Ｃｙ３的效价１：２００同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤２５）中处理过的切片２－４小时；２７）用ＴＮＴ洗涤步骤２６）中处理过的切片２次，室温，各１０－１５分钟；２８）将步骤２７）中处理过的切片表片，封片。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：武胜昔，魏燕燕，黄静，陈晶，王文，李云庆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87