利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种利用酵母表面展示系统分析单抗表位的方法及其在疫苗开发中的应用。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)构建目的蛋白的DNA文库；(2)将DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)将目的蛋白的单抗与酵母展示文库甲混合，分选出与单抗结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，分析所述目的蛋白的抗原表位。同传统方法相比，本发明专利技术的优点：(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径更多，可以展示大分子量和复杂蛋白；(2)酵母可采用FACS逐个筛选，提高准确性与筛选通量；(3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母本身即为免疫佐剂，可检验抗原表位能否再诱导类似活性的抗体产生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用。
技术介绍
宿主的抗体反应在抵抗病原体感染的过程中起着重要作用，而体内的多克隆抗体反应是由针对不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体组成的。深入的理解这个复杂的过程能够为研究疾病的发病机制提供关键的信息，还能够为高效疫苗的研发和疾病治疗提供重要的理论基础。在抗原表位的诸多研究方法中，兴起于1990年的噬菌体展示肽库技术(kott， J. K. and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990. 249 (4967) :p. 386-90.)，即用随机合成的短肽文库(一般6-12个氨基酸， 库容量达IOll-IO12)和噬菌体展示系统进行筛选的方法，以其快捷、准确、不受氨基酸位点限制的优点而逐渐成为目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。然而，噬菌体展示肽库技术也存在很大的局限性(1)短肽文库可以产生的绝大部分是线性表位，不能很好地模拟占抗原表位80%以上的构象型表位；(2)噬菌体的衣壳蛋白所能容纳的外源分子小、结构简单，对外源蛋白缺乏修饰，该系统中很多细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；C3)噬菌体个体过小，多采用亲合层析柱或亲合聚苯乙烯板进行筛选，筛选效率低；(4)每轮筛选后，噬菌体必须重新感染宿主细胞以便获得足够的病毒粒子进行下一轮筛选，重组病毒粒子间感染能力的差别会造成一定的扩增优势；( 噬菌体易被空气传播， 因而容易引起交叉污染。单克隆抗体的特点是能与抗原的专一表位结合，判断不同来源的单克隆抗体表位的异同，对了解抗体的使用价值和大规模抗体制备等均具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用。本专利技术提供的分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤(1)构建所述目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库甲；(3)将所述目的蛋白的单克隆抗体与所述酵母展示文库甲混合，分选出与所述单克隆抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位(各个质粒中插入的共有DNA片段编码的肽片段即为候选的识别表位)。所述T载体具体可为在PCTC0N2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5，末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T质粒。所述目的蛋白的编码基因的DNA片段具体插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点。所述酵母为可酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。所述步骤(1)中，构建所述DNA文库的方法可包括如下步骤①将所述目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50_100bp的DNA片段；②将步骤①回收的DNA片段进行随机片段重组；③将步骤②重组后的DNA片段加A尾；④将步骤③得到的加A尾后的DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。所述随机片段重组的反应体系具体可为90ng小片段DNA，4y 1 5XPhire buffer, 0. 8 μ 1 dNTPs,0. 5μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 个单位)，加 ddH20 至 20 μ 1。所述随机片段重组的反应程序具体可为95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟，10个循环或15个循环；72°C 10分钟；第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开始，每个循环比上个循环N增加k (即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒，以此类推)。所述反应程序中，优选10个循环或15个循环。也可用物理剪切法、随机引物扩增法和酶消化法等方法构建目标蛋白的DNA文库。所述宿主菌可为大肠杆菌，优选大肠杆菌Dffia。在进行所述步骤(1)前，可先通过PCR扩增所述目的蛋白的编码基因。所述PCR 扩增所用的酶可为高保真DNA聚合酶，优选为PyroBest DNA Polymerase0所述方法中，可利用流式细胞术进行步骤(3)中的所述分选。所述步骤O)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面可包括如下步骤①提取所述步骤(1)中得到的含有所述DNA文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母甲；②收集所述重组酵母甲诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库甲；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0所述方法还可包括如下步骤(5)构建所述步骤(4)分析获得的所述抗原表位的编码序列的DNA突变文库；所述DNA突变文库中，所述抗原表位的编码序列的突变DNA片段插入所述PCTC0N2-T质粒；(6)将所述DNA突变文库展示在所述酵母表面，得到酵母展示文库乙；(7)将所述目的蛋白的单克隆抗体和C-myc单抗一起与所述酵母展示文库乙混合，分选出与C-myc单抗结合且与所述目的蛋白的单克隆抗体不结合的酵母；(8)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述pCTC0N2-T质粒的DNA片段的核苷酸序列与所述抗原表位的编码序列的差异分析蛋白的抗原表位(与原基因序列进行比对，发生变化的核苷酸即为候选的破坏多肽片段与所述单克隆抗体结合的核苷酸，对应的氨基酸残基即为蛋白与单抗结合中的关键氨基酸残基)。所述步骤(5)中，构建所述DNA突变文库的方法可包括如下步骤①通过PCR扩增所述抗原表位的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为低保真DNA 聚合酶，优选为rTaq酶；②将所述PCR扩增产物插入所述PCTC0N2-T质粒的km I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA突变文库；所述方法中，可利用流式细胞术进行步骤(7)中的所述分选；所述步骤(6)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面可包括如下步骤①提取所述步骤( 中得到的含有所述DNA突变文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母乙；②收集所述重组酵母乙诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库乙；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6. 7g，酸水解酪素5g， NaHPO4 · 12H20 13. 6g, NaH2PO4 · H2O 8. 56g，加重蒸水至 IL0以上任一所述方法均可应用于研究抗原和抗体相互作用。以上任一所述方法在均可应用于疫苗研发。所述目的蛋白可为序列表的序列3所示的蛋白(H5W禽流感病本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤：（１）构建所述目的蛋白的ＤＮＡ文库；所述ＤＮＡ文库中，所述目的蛋白的编码基因的ＤＮＡ片段插入Ｔ载体；所述Ｔ载体含有酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的编码基因，且所述ＤＮＡ片段编码的肽片段的Ｎ端与所述酵母ａ凝集素Ａｇａ２ｐ的Ｃ端融合；（２）将所述ＤＮＡ文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库甲；（３）将所述目的蛋白的单克隆抗体与所述酵母展示文库甲混合，分选出与所述单克隆抗体结合的酵母；（４）将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述Ｔ载体的ＤＮＡ片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张林琦，史宣玲，左腾，汪桦，姚辰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11