本发明专利技术公开了几乎不含亚基的糖蛋白的组合物，所述的方法包括步骤：(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到溶液共晶点以下1-20℃的范围，并维持1-30小时；和(b)以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到不低于0℃，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的冻干粉末。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质药物的纯化领域。尤其涉及含有治疗不孕症的糖蛋白水溶液的冷冻干燥方法。
技术介绍
治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质，包括绒毛膜促性腺激素(HCG)、绝经期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)，其中绝经期促性腺素是含有卵泡刺激素和黄体生成素且两者成一定比例(1 0.1-1)的混合物。HCG、FSH、LH都是由α链和β链两个亚基通过非共价键的形式结合，其中它们的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。HCG的β亚基有145-147个氨基酸，分子量22200-39000D，其中第13、30位置上的天冬酰胺以及第121、127、132、145位置是发生糖基化的地方。FSH的 β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生 N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D。临床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特定妇女(孕期或绝经期)的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。治疗不孕症的糖蛋白的第一代产品是上世纪60年代Serono公司的 Profasi (HCG)、Pergonal (HMG)，它们的纯度都较低，含有大量杂质。上世纪80年代之后， Serono公司分别推出了 Metrodin-HP，它是一种杂质含量很低的高纯度的FSH制剂；后来又推出利用DNA重组技术生产的Gonal-F(rFSH)、Luveris (rLH)等，另外，Ferring公司也推出了高纯度绝经期促性腺素-Menopur。由此可见，目前市场上都在致力于高纯度糖蛋白的开发和应用，来替代普通的低纯度产品，以克服普通低纯度产品中的杂蛋白造成的过敏反应。但是，通过各种纯化手段获得的高纯度糖蛋白都要经过两个阶段，即原料药阶段和制剂成品阶段。这两个阶段可以是固体形式，也可以是液体形式。一般应尽量采用固体形式而不采用液体形式，对于原料药来说，液体形式不容易保存和运输，因为液体形式必须保存在-20°C以下，否则糖蛋白容易失活；液体形式由于会遇到冻结-溶解过程，甚至是反复的冻结_溶解过程，更容易导致糖蛋白失活；液体形式还会遇到包装容器在低温下接近脆性点容易破裂的危险等。而对于制剂成品来说，液体形式除了不容易运输外，还遇到液体形式的糖蛋白药物的稳定性较差，而且必须要加防腐剂才能保证在有效期内微生物不会滋生，如公开号为CN1309567A的专利申请。而固体形式的获得主要是通过冷冻干燥的手段，但高纯度的糖蛋白在冷冻干燥的过程中很容易发生变性失活，其变性失活主要表现为完整分子降解成α链和β链两个亚基，而这些亚基也是杂质，它们是没有疗效或可能产生副作用的异构物，因此目前的高纯度糖蛋白的冻干制剂在投料时都要多加10-30%的量，以抵消冷冻干燥过程的失活情况，而且成品中还会产生一定量的亚基，降低了产品的纯度。造成降解失活的原因，一方面是原辅料的配方不合理，一方面是冷冻干燥的工艺需要完善。因此，本领域迫切需要开发出一种适合治疗不孕症的糖蛋白的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种含有糖蛋白的水溶液的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。在本专利技术的第一方面，提供了一种亚基含量不超过10wt%的糖蛋白的组合物。在另一优选例中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、绝经期促性腺素、卵泡刺激素、黄体生成素、或其混合。在另一优选例中，所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和/或重组的人绒毛膜促性腺激素、或其变体；所述绝经期促性腺素是人尿来源和/或重组的人绝经期促性腺素、或其变体；所述卵泡刺激素是人尿来源和/或重组的人卵泡刺激素、或其变体；所述黄体生成素是人尿来源和/或重组的人黄体生成素、或其变体。在另一优选例中，所述糖蛋白的组合物的亚基含量不超过5wt%。在另一优选例中，所述的组合物是冷冻干燥粉末。在本专利技术的第二方面，提供了一种含糖蛋白水溶液的冷冻干燥方法，所述的方法包括步骤(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0. 05-5°C /分钟的升温速率将搁板温度升到溶液共晶点以下1-20°C，并维持1-30小时；和(b)以0. 05_5°C /分钟的升温速率将搁板温度升到彡0°C，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的冻干粉末。在另一优选例中，步骤(a)中的升温速率为0. 07-30C /分钟；步骤(b)中的升温速率为0. 06-1. 5°C /分钟；更佳地，在步骤(a)前还包括下述步骤将含有糖蛋白水溶液预冻0. 5-5小时。在另一优选例中，所述的含有糖蛋白水溶液中糖蛋白的浓度为1 μ g/mL-80mg/mL ； 更佳地,浓度为500 μ g/mL-60mg/mL。在另一优选例中，步骤(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中的糖蛋白是高纯度糖蛋白。在另一优选例中，在步骤(b)中得到含有亚基含量< 10wt%的糖蛋白的冻干粉末；更佳地，亚基含量< 5wt% ；最佳地，亚基含量< 3wt%。在另一优选例中，步骤(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中还含有选自下述一种或多种糖类保护剂乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐；所述的糖类保护剂在含有糖蛋白水溶液中的浓度为2-60mg/ml。在另一优选例中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合。在另一优选例中，所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和/或重组的人绒毛膜促性腺激素、或其变体；所述绝经期促性腺素是人尿来源和/或重组的人绝经期促性腺素、或其变体；所述卵泡刺激素是人尿来源和/或重组的人卵泡刺激素、或其变体；所述黄体生成素是人尿来源和/或重组的人黄体生成素、或其变体。在本专利技术的第三方面，提供了一种如上所述的本专利技术提供的组合物在用于制备治疗不育综合症的药物中的用途。在本专利技术的第四方面，提供了一种如上所述的本专利技术提供的方法制备得到的糖蛋白。在本专利技术的第五方面，提供了一种如上所述的本专利技术提供的方法制备得到的糖蛋白在用于制备治疗不育综合症的药物中的用途。据此，本专利技术提供了一种适合治疗不孕症的糖蛋白的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。附图说明图1显示了实施例1中冷冻干燥前的FSH的液相图谱。图2显示了实施例1中冷冻干燥后的FSH的液相图谱。具体实施例方式专利技术人在实验中发现，冷冻干燥过程中，同样的冻干工艺对于象胰蛋白酶抑制剂 (UTI)等单链结构的蛋白质和象HCG、FSH、LH等双链结构的糖蛋白的影响是不同的，前者几乎没有任何失活现象，而后者很容易降解出亚基并表现出失活的结果。因此，本专利技术人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现，在冷冻干燥过程中，过快的升温过程是导致糖蛋白的降解从而发生变性失活的主要原因。正如前所述，此类糖蛋白都由两条链以非共价键的形式结合，也就是以疏水作用、氢键等较弱的力来维系，它们与辅料等其它组成物在预冻过程均勻分布在水分子的冰晶中，然而在过快的升温过程中，搁板会以较大的热流速率传递给产品的冰晶结构，而且此时冻干机腔内的真空度非常高，因此就使得冰晶内的水分子在较短的时间内迅速升华变成本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种糖蛋白的组合物，其特征在于是由如下方法制备而成：计算出的一定量的以生物效价为单位的ｈｐＨＭＧ精品溶解于５０ｍＬ注射用无热原水中，用ＨＣｌ或ＮａＯＨ调节ｐＨ ６．５±０．２，然后用０．２２μｍ过滤器进行无菌过滤；将２００ｇ乳糖溶解于２Ｌ注射用无热原水中，用ＨＣｌ或ＮａＯＨ调节ｐＨ ６．５±０．２，用０．２２μｍ过滤器进行无菌过滤；然后加入到ＦＳＨ溶液中，用注射用无热原水定容至７．５Ｌ，混匀；此溶液的共晶点为－２℃；将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶０．７５ｍＬ，按如下程序进行冷冻干燥：（１）搁板温度至－４０℃预冻３小时；（２）冷阱至－４５℃；（３）启动真空泵；（４）搁板温度以０．５℃／ｍｉｎ的速率从－４０℃升温至－１０℃，搁板温度达到－１０℃后维持１０小时；（５）搁板温度以０．３７５℃／ｍｉ ｎ的速率从－１０℃升温至＋３５℃，搁板达到＋３５℃后维持１０小时；（６）压塞，出箱。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季晓铭，高霄梁，季斌，严惠敏，洪云海，
申请(专利权)人：上海天伟生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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