以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用技术方案

本发明专利技术以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用，属于基因工程技术领域。该系统以BADH作为外源基因的标记基因，以NaCl作为选择剂；其应用包括下述步骤：(1)确定正好能抑制植物组织分化的NaCl浓度；(2)将含有BADH基因的外源基因转化入植物细胞或组织中；(3)将转化了BADH标记基因的转基因组织或细胞放置在步骤(1)所确定的NaCl浓度的培养基上进行培养，能够生长发育的即为可能转化了BADH标记基因的转基因组织或细胞，经分子检测进行确定。本发明专利技术具有大大降低了在转基因试验中的成本投入；解决了转基因生物安全性问题，为建立安全有效的植物遗传转化的选择系统提供了低成本选择的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统及其应用。
技术介绍
运用基因工程技术实现植物性状的遗传改良已经成为培育植物新品种的一种新趋势。在植物转基因过程中，有效的选择系统的采用是植物转基因成功与否的一个关键环节。目前最常用的选择系统为除草剂选择系统和抗生素选择系统，尽管这两种选择系统已经成功地用于多种植物的遗传转化，但这两种选择系统的采用却是引发公众对转基因生物安全性关注的一个重要原因。一方面，人们担心转基因植物中的抗生素抗性基因会转移到环境微生物中，结果会导致抗性病原体的增加；另一方面，抗除草剂基因可能会传给野生杂草，从而使杂草获得除草剂抗性。虽然这些担心还没有科学依据，但公众对选择标记基因的潜在危害的担心会严重影响植物基因工程的发展，所以，建立安全有效的植物遗传转化的选择系统，培育无抗性标记基因的转基因植物在基因工程育种上有着重要意义。当前，解决转基因植物中抗性标记基因安全性问题有两种途径(1)转化时仍使用抗性标记基因，转基因植物再生成功后，在释放大田前将抗性标记基因剔除；( 发展安全性标记基因用于植物遗传转化(赵艳，王慧中，于彦春等.转基因植物中标记基因的安全性新策略.遗传，2003,25(1) :119-122)。由于前一种途径操作复杂，不利于转基因植物的快速商品化应用，因此目前在植物转基因操作上多倾向于采用安全性标记基因的遗传转化法。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因是甜菜碱代谢途径中的关键酶，该酶能把对植物有毒的甜菜碱醛(又名甲酰甲基三甲基氯化胺，英文名Betaine aldehyde chloride ；分子式C5H12C1N0)转化为有利的甜菜碱，是国际上公认的安全性基因，并可兼作标记基因使用。许多转基因成果表明外源BADH基因的导入可提高植物合成甜菜碱的能力，并增强植物的抗旱性、耐盐性等(Sakamoto A, Murata N. The role of glycine betaine in protection of plants from stress clues from transgenic plants. Plant Cell and Evironment,2002,25 :163-171 ；付光明，苏乔，吴畏等.转BADH基因玉米的获得及其耐盐性.辽宁师范大学学气，2006，四(3) :344-347)。目前，以甜菜碱醛脱氢酶基因兼作标记 SHEliini ^ (H Daniell, B Muthukumar, S B Lee. Marker free transgenic plants engineeringthe chloroplast genome without the use of antibiotic selection. Current Genetics, 2001, 39 (2) :109-116)、二色胡枝子(杨晓红· BADH 基因、反义 4CL 基因对二色胡枝子的遗传转化研究.北京林业大学博士学位论文，2009)上取得了成功。尽管这种遗传转化技术已经被证实是可行的，但是该种转化方法是以甜菜碱醛提供选择压， 而甜菜碱醛则是一种价格极其昂贵的选择剂，国际市场价高达1000美元/克左右，国内价格也达2500 3000元/克，造成该种遗传转化成本极高，进而限制了这种遗传转化方法的广泛使用。因此，探索以甜菜碱醛脱氢酶基因兼作标记基因的低成本遗传转化方法，对促进这种安全性遗传转化方法的广泛使用和转基因成果的快速商品化应用具有重要意义。
技术实现思路
NaCl是种对植物组织、细胞发育产生毒害的化合物，其产生的Na+在细胞中大量积累会破坏细胞内离子平衡并抑制细胞内生理生化代谢过程，使植物光合作用能力下降， 最终因碳饥饿而死亡。植物在含有一定浓度的NaCl培养基上则不能进行正常的组织分化， NaCl浓度高时，植物会死亡。但NaCl价格低廉，每500克才6 8元人民币，在市场上很容易买到。在以BADH基因兼作选择标记基因时，由NaCl提供选择压，以这种成本低廉的化合物作为选择剂，对拟转化的植物外植体，先将其置于含有不同浓度的NaCl培养基上，观察 NaCl对植物组织分化的影响程度，找到正好能抑制植物组织进行分化的NaCl浓度，以此浓度作为植物遗传转化过程中NaCl选择剂浓度。由于转入BADH基因的植物组织或细胞具有提高耐盐性的特点，因此，在含有一定浓度的NaCl培养基上，转BADH基因的细胞或组织能够正常分化生长，非转化细胞或组织不能分化，从而可获得具有NaCl抗性的抗性芽，这些抗性芽可作为转入外源基因的植株初始材料。以后，使这些抗性芽进一步在含有一定浓度的NaCl培养基上生长发育，并对其进行分子检测，就能够获得以BADH基因兼做标记基因的转基因植株。为了解决目前在采用BADH作为外源基因的标记基因、以甜菜碱醛提供选择压时， 所造成的遗传转化成本极高的问题，本专利技术提供了一种以BADH作为标记基因时的植物转基因选择系统并同时提供了这种植物转基因选择系统的应用。以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统，包含外源基因和选择剂，其中，所述外源基因中含有作为选择标记基因的BADH，所述选择剂为NaCl。上述技术方案所述的植物转基因选择系统，其中，所述植物为二色胡枝子或烟草。上述技术方案中所述的以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在植物转基因工程中的应用，包括通过转基因方法将以BADH作为选择标记基因的外源基因导入植物中，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前的植物的组织或细胞培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制植物组织或细胞进行分化的NaCl浓度；O)、将获得的可能转化了外源基因的具有NaCl抗性的组织或细胞放置在步骤 (1)所确定的NaCl浓度的培养基上进行培养，能够生长发育的即为转入了 BADH作为选择标记基因的外源基因的材料。上述技术方案中所述的应用，其中，以BADH作为标记基因的植物转基因选择系统在二色胡枝子或烟草转基因工程中的应用。上述技术方案中所述的应用，包括通过转基因方法将以BADH为标记基因的外源基因转入二色胡枝子中的步骤，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前二色胡枝子子叶节不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl， 确定正好能抑制二色胡枝子子叶节不定芽分化的NaCl浓度；O)、将上述转入了外源基因的二色胡枝子子叶节置于含有步骤(1)中确定的 NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前二色胡枝子不定芽增殖和生根的培养基中加入不同浓度的NaCl， 确定正好能抑制二色胡枝子不定芽增殖和生根的NaCl浓度；(4)、将步骤O)中获得的耐盐抗性芽在步骤(3)所确定的NaCl浓度的培养基中进行选择性增殖和生根，以加强选择效果。上述技术方案中所述的应用，包括通过转基因方法将以BADH为标记基因的外源基因转入烟草叶片中的步骤，其中，还包括下述步骤(1)、在转基因前烟草叶片不定芽分化的培养基中加入不同浓度的NaCl，确定正好能抑制烟草叶片不定芽分化的NaCl浓度；(2)、将转入了外源基因的烟草叶片置于含有步骤⑴中确定的NaCl浓度的相同培养基中进行选择；(3)、在转基因前烟草茎段增殖和组培苗生根的培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．以ＢＡＤＨ作为标记基因的植物转基因选择系统，包含外源基因和选择剂，其特征在于：所述外源基因中含有作为选择标记基因的ＢＡＤＨ，所述选择剂为ＮａＣｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓红，刘雯，陈晓阳，解小娟，冷平生，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：11