本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤：A．大麦茎尖培养及载体构建：1）选取大麦颖果，去除稃片，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2）从中间载体pMBL-3及和绿色荧光蛋白基因GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，步骤：1）大麦茎尖的获取；2）茎尖的浸染；3）茎尖和农杆菌GV3101共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液；4）茎尖的恢复培养基；5）茎尖的筛选培养基；6）再生植株的春化和栽培，得到候选的转化植株。方法易行，操作简便，周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及根癌农杆菌介导的以大麦茎尖为材料的培育转基因植株的方法。本专利技术涉及大麦茎尖材料制备及处理方法，与根癌农杆菌结合用于大麦栽培品种的遗传转化。
技术介绍
大麦是世界上最重要的作物之一，其种植面积和产量均是列于小麦、玉米和水稻之后、位于第四的重要禾谷类作物，主要用作食粮、饲料、啤酒工业原料以及医药工业原料和保健食品。Tingay等于1997年首次以农杆菌介导法成功转化大麦幼胚，获得转基因大麦植株，随后农杆菌介导的转化方法逐步发展成为大麦遗传转化的重要方法(Tingay S，McElroy D，Kalla R，Fieg S，Wang M，Thornton S &Brettell R. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. J Plant，1997，11 :1369-1376 ；McCormac A C，Wu H，Bao M，Wang Y，Xu R，Elliott M C & Chen D F. The use of visual marker genes as cell-specific reporters of Agrobacterium—mediated T-DNA delivery to wheat(Triticum aestivum L. ) and Barley (Hordeum vulgare L. ). Euphytica， 1998,99 :17-25 ；Matthews P R，Wang M B，Waterhouse P M，Thornton S，Fieg S J， Gubler F，Jacobsen J V. Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent ‘twin T-DNAs’ on a standard Agrobacterium transformation vector. Mol Breeding,2001, 7 :195-202 ；Murray FiBrettell RiMatthews P，Bishop D，Jacobsen J. Comparison of Agrobacterium-mediated transformation of four barley cultivars using the GFP and GUS reporter genes. Plant Cell Rep,2004, 22 :397-402 ；Wu H， McCormac A C， Elliott M C & Chen D F. Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspension cultures of barley(Hordeum vulgare L.).Plant Cell Tiss. Org. Cult,1998,54 :161-171 ；Trifonova A, Madsen S, Olesen A. Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions. Plant Sci，2001，161 :871-880 ； Fang Y D，Akula C，Altpeter F. Agrobacterium-mediated barley (Hordeum vulgare L.) transformation using green fluorescent protein as a visual marker and sequence analysis of the T-DNA:: barley genomic DNA junctions. J Plant Physiol，2002， 159 :1131-1138 ；Travella S，Ross S M，Harden J，Everett C，Snape J W, Harwood W A. A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques. Plant Cell Rep,2005, 23 :780-789 ；Kumlehn J，Serazetdinova L，Hensel G，Becker D，Loerz H. Genetic transformation of barley(Hordeum vulgare L.) via infection of androgenetic pollen cultures with Agrobacterium tumefaciens. Plant Biotechnol J，2006，4 :251-261 ； Inger BA|kstedHolme，Henrik Brinch-Pedersen, Mette Lange, Preben Bach Holm. Transformation of different barley(Hordeum vulgare L.) cultivars by Agrobacterium tumefaciens infection of in vitro cultured ovules. Plant Cell Reports，2008，27，1833-1840 等等)。然而，Tingay等采用的方法是先以基因枪轰击大麦愈伤组织，再以农杆菌进行转化。 虽然获得了转基因植株，但实验难度大、成本高。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是以开花后15天左右的幼胚为转化受体，利用模式品种Golden promise 用于转化，而以栽培大麦品种开展转化的研究受到限制，转化频率也不高。在实际工作中， 由于大麦生长周期长，从播种至幼胚形成需要约150天，田间一年仅能取材一次用于转化， 因此，必须改进现有技术体系的缺陷和不足。本专利技术从最关键的转化受体及其培养转化筛选程序入手，专利技术了直接以茎尖为受体用于转化，进一步克服了茎尖培养、农杆菌侵染及转基因材料筛选鉴定过程中的关键问题，从而建立一种高效的根癌农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化方法。 利用植物茎尖为转化受体，不仅不需要以幼胚为受体时从播种至开花灌浆期的长时间植物栽培管理周期，也不必经过诱导愈伤及分化成苗阶段，转化后可以直接成苗，转化及成苗周期短。茎尖已用于一些双子叶植物遗传转化，包括大豆、棉花、 花生、向日葵、葡萄和豌豆，以及部分单子叶植物的转化。在大麦中，以基因枪介导的大麦茎尖转化已经报道(Christou P, McCabe DE, Martinell BJ, SwainffF. Soybean genetic Engineering-co本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤是：Ａ、大麦茎尖培养及载体构建：１）选取大麦颖果，去除稃片，用７０％ｖ／ｖ乙醇浸泡３ｍｉｎ，然后用０．１％ｗ／ｖＨｇＣｌ２浸泡１３～１５ｍｉｎ，无菌水冲洗３－５次每次１－３ｍｉｎ，消毒的种子浸泡在无菌水中、室温萌动１５－１７ｈ，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；２）从中间载体ｐＭＢＬ－３及和绿色荧光蛋白基因ＧＦＰ用酶切和ＰＣＲ方法获得玉米泛素启动子及相关序列，克隆连接到以ｐＵＣ１８的载体上，构建形成了ｐＭＢＬ９植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌；Ｂ、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，它包括以下步骤：１）、大麦茎尖的获取：取大麦成熟胚在２１－２４℃萌发生长３－５天的幼苗，除去幼苗的根、盾片及幼叶，留下４－６ｍｍ的茎尖，用针刺伤生长点，置于高渗培养基上处理１－３小时；２）、茎尖的浸染：从步骤１）得到大麦茎尖，加入用农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌ＧＶ３１０１菌液，浸染茎尖２４－２６ｍｉｎ，超声波处理１４－１６ｓ；３）、茎尖和农杆菌ＧＶ３１０１共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于２１－２４℃共培养１－３天；４）、茎尖的恢复培养基：将步骤３）中的茎尖转至恢复培养基，于２３－２７℃下培养６－８天；５）、茎尖的筛选培养基：将恢复培养后的茎尖转到筛选培养基上筛选２－４轮，每轮９－１１天；６）、再生植株的春化和栽培：将筛选获得的阳性苗转至生根培养基上９－１１天，再春化处理２周后，移栽到土钵中，于生长室中培养，２３－２７℃，２０００Ｌｕｘ，光照培养至移栽，得到候选的转化植株；所述的萌发培养基：１９００ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ３，１６５０ｍｇ／Ｌ ＮＨ４ＮＯ３，１７０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，３７０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，４４０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，２７．８ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，３７．３ｍｇ／Ｌ Ｎａ２·ＥＤＴＡ，０．８３ｍｇ／Ｌ ＫＩ，６．２ｍｇ／ＬＨ３ＢＯ３，２２．３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ，８．６ｍｇ／ＬＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．２５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ，１．２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．０２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，２ｍｇ／Ｌ甘氨酸，１ｍｇ／Ｌ ＶＢ１，０．５ｍｇ／Ｌ ＶＢ６，０．５ｍｇ／Ｌ ＶＢ５，６９０ｍｇ／Ｌ脯氨酸，２５０ｍｇ／Ｌ肌醇，１０００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白，３０ｇ／Ｌ麦芽糖，６ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ５．８；所述的高渗培养基：１９００ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ３，１６５０ｍｇ／Ｌ ＮＨ４ＮＯ３，１７０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，３７０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，４４０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，２７．８ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，３７．３ｍｇ／Ｌ Ｎａ２·ＥＤＴＡ，０．８３ｍｇ／Ｌ ＫＩ，６．２ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３，２２．３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ，８．６ｍｇ／ＬＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．２５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ，１．２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．０２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，２ｍｇ／Ｌ甘氨酸，１ｍｇ／Ｌ ＶＢ１，０．５ｍｇ／Ｌ ＶＢ６，０．５ｍｇ／Ｌ ＶＢ５，１ｇ／Ｌ水解酪蛋白，０．６９ｇ／Ｌ Ｌ－脯氨酸，０．４ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋６ｇ／Ｌ琼脂粉，ｐＨ ５．８；所述的农杆菌浸染培养基：１９０ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ３，１６５ｍｇ／Ｌ ＮＨ４ＮＯ３，１７ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，３７ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，４４ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，２．７８ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，３．７３ｍｇ／Ｌ Ｎａ２·ＥＤＴＡ，０．０８３ｍｇ／Ｌ ＫＩ，０．６２ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３，２．２３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ，０．８６ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．０２５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ，０．１２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，０．００２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，０．２ｍｇ／Ｌ甘氨酸，０．１ｍｇ／Ｌ ＶＢ１，０．０５ｍｇ／Ｌ ＶＢ６，０．０５ｍｇ／Ｌ ＶＢ５，２００ｍｇ／Ｌ Ｌ－脯氨酸，３００ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白，１００ｍｇ／Ｌ Ｖｃ，１．９５ｇ／Ｌ ＭＥＳ，４５ｇ／Ｌ麦芽糖，１０ｇ／Ｌ葡萄糖，４０μＬ／Ｌ Ｌ－７７，０．５ｇ／Ｌ谷氨酰胺，ｐＨ ５．２。使用时加１‰ １ｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，抽滤灭菌；所述的共培养培养基：１９００ｍｇ／Ｌ ＫＮＯ３，１６５０ｍｇ／Ｌ ＮＨ４ＮＯ３，１７０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，３７０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，４４０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，２７．８ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，３７．３ｍｇ／Ｌ Ｎａ２·ＥＤＴＡ，０．８３ｍｇ／Ｌ ＫＩ，６．２ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３，２２．３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，李和平，刘正位，高春生，黎冬华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83
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