本发明专利技术涉及一种抗菌多肽及其制备方法和应用，属于生物医学领域。本发明专利技术抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。通过将抗菌多肽的编码序列经限制性内切酶线性化后采用电击法转化入毕赤酵母(Pichia?pastoris)GS115中，通过同源重组到酵母染色体上，用G418筛选高表达菌株，甲醇诱导表达，可获得该抗菌多肽。试验证明该抗菌多肽在体内外对多种细菌、病毒、肿瘤细胞、癌实体瘤、真菌和原虫均有抑杀作用，且不易产生抗性，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性药物、饲料添加剂、防腐剂、消杀剂等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种抗菌多肽以及该抗菌多肽的制备方法和用途。
技术介绍
抗生素对于控制、预防和治疗各种感染性疾病发挥了重要作用。由于抗生素的使用，到20世纪80年代，人类几乎可以征服所有的感染类疾病，然而，随着时间的推移以及抗生素的滥用，耐药菌株愈来愈多。有监测发现，最具代表性的耐药菌株当中，耐药的葡萄球菌已上升到40% ；耐药的凝固酶阴性葡萄球菌则超过77%。现在，已经出现了能对抗所有抗生素的耐药菌，很明显，抗生素耐药问题已经严重威胁到人类的健康。解除耐药菌对人类日益严重的威胁已经是一个相当迫切的问题，因此新一类抗微生物物质的发现和研制已经成为国际上研究的热点。多肽类抗菌物质与目前广泛使用的传统类抗生素相比，具有很多优点如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效。 目前，已从不同生物中提取出多种抗菌肽。人防御素属于抗菌肽家族，是存在于人多形核中性粒细胞、巨噬细胞、小肠Paneth 细胞中的一组同源肽类，是富含精氨酸残基的阳离子多肽，分子量为4 6kDa，分子中含有 6-8个Cys残基，并形成3 4对分子内二硫键，具有稳定的分子结构和广谱抗菌活性。在体内外对多种细菌、病毒、肿瘤细胞、癌实体瘤、真菌和原虫均有抑杀作用，且微生物不易对其产生抗性。因此人防御素有望成为理想的抗生素替代品，具有巨大的应用价值。但由于抗菌肽在生物体中含量不高，且提取困难，成本高，故寻找来源易，成本低、效价高的抗菌肽正受到广泛的重视。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种抗菌多肽；本专利技术的第二个目的在于提供编码该抗菌多肽的基因；本专利技术的第三个目的在于提供该抗菌多肽的制备方法；本专利技术的再一个目的在于提供该抗菌多肽的用途。本专利技术在对人防御素4的序列、结构分析的基础上，进行改进优化，与人防御素4 相比，除了具有抗菌作用外，还有抗病毒作用，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列，例如，将第6 位的Leu替换为lie，或者在其末端缺失Thr Arg Val三个氨基酸。因此，本专利技术抗菌多肽还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQ ID No. 2衍生得到的多肽。为方便表述，将该多肽命名为ABP-jl。本专利技术基因包括编码所述多肽的核酸序列，优选其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术3人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。可将本专利技术基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本专利技术多肽的重组表达载体，进而可以通过诸如电转化法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主细胞，得到转 ABP-jl基因的转化体，例如基因工程菌。因此，本专利技术还包括含有编码上述抗菌多肽的表达载体，以及转化了该表达载体的宿主细胞。本专利技术还提供了一种制备上述多肽的方法，其是将上述表达载体转化宿主菌，筛选阳性克隆，诱导表达权利要求1所述抗菌多肽，并分离纯化。在本专利技术的一个实施例中，将编码上述多肽的基因(其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示)克隆至表达载体PPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-ABP-j 1，进而通过电击法转化入毕赤酵母(Pichia past0ris)GS115中；通过同源重组整合到酵母染色体上；用G418筛选高表达菌株；甲醇诱导表达。具体地，本专利技术制备上述多肽的方法包括如下步骤1、该抗菌多肽的重组毕赤酵母表达载体的构建根据ABP-jl核酸序列和毕赤酵母表达载体PPIC9K上的限制性内切酶位点特性，在ABP-j 1核酸序列上下游分别增加EcoRI 和NotI位点，用EcoRI和NotI双酶切，再与EcoRI和NotI双酶切过的pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5a，构建该抗菌多肽的毕赤酵母表达载体pPIC9K-ABP_jl。提取质粒，经EcoRI 和NotI双酶切、测序鉴定。证实该抗菌多肽毕赤酵母表达载体pPIC9K-ABP-jl构建成功。2、毕赤酵母的转化及筛选用限制性内切酶如&iCI、BglII将重组质粒线性化，取约5 μ 1线性DNA 1 μ g与200 μ 1甲醇酵母GSl 15感受态细胞混合，然后注入预冷的0. 2cm 电击杯中，轻敲电击杯，使混合物落于电击杯底部，在电击仪上设定电压为1500V，电容为 50 μ F，电流25mA，电功率25W，电阻200 Ω，进行电穿孔操作。电穿孔后立即加入Iml预冷的 IM D-山梨醇，混勻后从中吸出200 μ 1立即涂布于含2. Omg/ml G418的MD D-山梨醇平板 (1. 34% YNB，4X 10_5%生物素，2% D-葡萄糖，IM D-山梨醇)，然后倒置平板于28 30°C 培养，2 4天后出现转化子，筛选出高表达菌株。随机挑取生长出的酵母菌落于YPD培养，按照Promega公司酵母基因组提取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增ABP-jl基因，琼脂糖凝胶电泳，紫外光下可见约IlObp大小的明显条带，与ABP-jl核酸序列大小一致，说明酵母高效表达菌株建立成功。3、诱导表达挑取阳性克隆，分别接种于50mlBMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养至0D600在4 6之间时取出，1500g离心5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有1/5体积的BMMY培养基三角瓶中继续培养，M小时以后，每天补加甲醇至终浓度为0. 5 1%。持续培养6 10天，离心取上清。直接取ABP-jl酵母表达上清作SDS-PAGE，电泳显示有目的蛋白表达，经测定蛋白量可达到500mg/L左右。Western-blotting检测可见ABP-jl表达条带。用标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株混菌板鉴定活性，并通过测定表明本专利技术抗菌多肽对病毒、常见细菌均有较强的抑制作用，动物急毒性试验、全身过敏试验和长期毒性试验表明该抗菌多肽是安全的，可依此方法研制新型高效抗生素替代品。本专利技术抗菌多肽可以用于制备抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂。进而本专利技术还提供一种含有有效剂量的所述抗菌多肽的抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂。本专利技术方法可以大量、高效的制备该抗菌多肽，由此方法制得的抗生素替代品具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性的生物学特性，且不易产生耐药性。附图说明图1 重组表达载体pPC9K-ABP_j 1的构建流程图。图2 =ABP-Jl抗菌肽SDS-PAGE电泳图，其中，1 蛋白质分子量标准；2 诱导后上清；3 诱导前上清。图3 :ABP_jl抗菌肽Wfestern blotting检测图，其中1 目的蛋白条带；M 蛋白质分子量标准。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种抗菌多肽，其是：１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示的氨基酸序列组成的多肽；或，２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示氨基酸序列经取代、缺失和／或添加一个或几个氨基酸获得的具有同等功能的由１）衍生的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张日俊，胡晓年，解军，于保锋，李翔，王俊丽，向前，余占桥，马青山，赵龙妹，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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