本发明专利技术涉及检测麻痹性贝毒的检测技术，特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗麻痹性贝毒的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与膝沟藻毒素GTX2/3抗原结合，而分析生物样品中膝沟藻毒素GTX2/3含量的快速检测试剂盒的制法。一种快速检测麻痹性贝毒主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆板条、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，利用制得的含特异性抗膝沟藻毒素GTX2/3单克隆抗体，在96孔酶标板上包被有合成的蛋白偶联物的包被抗原。本发明专利技术试剂盒具有前处理简单、易操作，适于现场、快速、大批量样品的检测等优点，试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒的检出限小于15ng/ml。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测赤潮毒素的检测器具，一种麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)的快速检测试剂盒。特别是涉及一种利用蛋白偶联合成抗原，制备抗麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的单克隆抗体，并涉及利用单克隆抗体与GTX2/3抗原结合，而分析检测生物样品中的麻痹性毒素含量的快速方便检测试剂盒的制法。
技术介绍
赤潮灾害日益严重，已成为一种全球性的海洋生态灾害。赤潮是目前我国海洋环境中最严重的生态灾害之一。我国赤潮海域逐年扩大，灾害逐年加重，每年因赤潮造成的经济损失非常巨大。赤潮生物通过分泌毒素，危害海洋动物及人类健康，不但可导致海水增养殖鱼虾贝大量死亡；而且由于食用含有贝毒的鱼虾贝等海产品，可导致人体发生中毒，甚至死亡，从上世纪60年代至今，我国已发生赤潮毒素中毒人数650多人，死亡40多人。麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)是我国近岸海域最常见的赤潮生物毒素或贝毒之一，在近岸海域贝类体内经常检出。Alexandrium tamarense等多种藻可以产生麻痹性贝毒。麻痹性贝毒(PSP)是一类具有四氢嘌呤结构的化合物，呈碱性，易溶于水，在弱酸和低温条件下比较稳定，碱性条件下发生氧化。现已发现此类化合物有20多种，根据R4基团的不同可以分为四类，分别是①氨基甲酸脂类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(neosaxiton，neoSTX)，膝沟藻毒素 GTX1、GTX2、GTX3、 GTX4 ；② N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括 GTX5 (Bi)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3 和 C4 ；③脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，包括 dcSTX、deneoSTX、 dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 ；④脱氧氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括 doSTX、doGTXldoGTX2。在这些化合物中，STX、neoSTX、GTXU GTX2、GTX3、GTX4 的毒性较大；dcSTX、deneoSTX、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4 毒性较小；GTX5(B1)、GTX6 (B2)、 Cl、C2、C3和C4毒性最小。麻痹性贝毒在全世界沿海都有分布，因赤潮生物种类及其地理分布不同，主要成分也不同，在温带海域最常见的毒素是GTX2、GTX3和STX，我国南方海域麻痹性赤潮毒素组份与此相似。麻痹性贝毒可在滤食性贝类体内大量积累，贝类被人类食用后，会导致中毒，使人四肢面部肌肉麻痹、头痛恶心，甚至窒息死亡。这类毒素主要作用于神经细胞和肌肉细胞的钠离子通道，阻断钠离子内流，妨碍动作电位的形成，因此表现出神经中毒的特征。目前国际上普遍使用的麻痹性贝毒分析方法是生物小鼠法，用盐酸在高温下提取藻类或贝体中的麻痹性毒素，然后对小鼠进行腹腔注射，根据小鼠的死亡时间判断毒性大小。但是在提取过程中有可能导致贝毒化合物的结构转化而改变毒性，同时用小鼠法测定贝毒含量存在误差大、重现性差，可比性低的缺点。高效液相色谱技术(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是目前分析鉴定麻痹性贝毒的准确有效方法，其原理是PSP毒素在碱性条件下氧化生成荧光物质，进行荧光检测。但其缺点是仪器及分析试剂昂贵、标准物质缺乏，样品前期处理麻烦，操作复杂，难以现场应用。目前国际普遍流行的简单快速准确的贝毒检测方法是酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbantassay, ELISA)，其优点是样品前处理简便，操作简单，灵敏度较高，方便迅速，能大批量检测样品，可应用于现场监测。其原理是抗体高度特异地与抗原分子结合，通过抗原-抗体的特异性识别反应来进行检测，既能定性又能定量，具有灵敏、简单和专一的特点。在多肽激素、 肿瘤标记、细胞因子、药物监控化合物、传播抗原等领域，得到了广泛的应用。近年来，我国每年均有在贝中检测出麻痹性贝毒的报道，时有中毒及死亡的事件发生，已严重的影响了贝类进出口贸易发展，引起各级政府及消费者的极大关注。建立麻痹性贝毒的快速灵敏准确的检测技术和产品，对确保海产品食用安全及维持贝类养殖的健康发展具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述麻痹性贝毒检测技术的不足，提供一种特异、敏感和简便的快速检测麻痹性贝毒的酶联免疫检测试剂盒；提供一种抗麻痹性贝毒单克隆抗体的制备，并利用抗麻痹性贝毒单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析膝沟藻毒素GTX2/3的试剂盒，简单易操作，适于现场、快速、大批量样品的分析检测。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是一种快速检测麻痹性贝毒的快速酶联免疫试剂盒，包括使用甲醛连接法，按一定反应比例将石房蛤毒素STX偶联到血蓝蛋白 (KLH)上，经透析提纯偶联物，用150μ g加佐剂充分乳化，腹腔注射免疫BALB/C鼠，加强免疫数次后，取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，阳性检测、克隆筛选、扩大培养及诱生腹水制得抗麻痹性贝毒主要组分膝沟藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的单克隆抗体； 用合成的STX-卵清蛋白(STX-OVA)包被96孔酶标板，加入GTX2/3标准品或样品，再加入稀释的单克隆抗体Mab-PSP，包被抗原中的GTX2/3与自由的GTX2/3竞争抗体Mab-PSP，自由的GTX2/3和抗体复合物被洗去，与包被抗原STX结合的抗体STX-Mab-PSP再与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，经底物显色，终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，样品中自由的GTX2/3含量越少，对照标准品回归的方程或曲线，计算样品中GTX2/3的含量。本技术专利技术的有益效果是利用制得的含特异性抗GTX2/3或STX的单克隆抗体， 所研制的酶联免疫检测试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒的检出限小于15ng/ml。与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点本专利技术的检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫检测试剂盒，具有特异性强，检测灵敏度高(可达15ng/ml)，检测快速，前处理简单，检测成本低，操作简单易掌握等优点。麻痹性贝毒的酶联免疫检测试剂盒，包括已包被有包被抗原的可拆96孔酶标板 (8孔X 12条)、洗液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、底物溶液、抗麻痹性贝毒的单克隆抗体；96孔可拆酶标板板条上预先包被有合成的包被抗原(麻痹性贝毒半抗原与蛋白偶联物)。所述抗麻痹性贝毒的单克隆抗体为用石房蛤毒素-血蓝蛋白偶联物免疫Balb/c 小鼠，经细胞融合，筛选得到抗麻痹性贝毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系分泌的。所述试剂盒为检测麻痹性贝毒的主要成分膝沟藻毒素GTX2/3的试剂盒。所述快速检测麻痹性贝毒膝沟藻毒素GTX2/3的酶联免疫试剂盒的制法，其步骤包括1、将石房蛤毒素与载体蛋白偶联，制备得到石房蛤毒素-载体蛋白偶联物；2、用石房蛤毒素-血蓝蛋白偶联物免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗膝沟藻毒素GTX2/3和石房蛤毒素STX的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分泌特异性单克隆抗体的融合细胞株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁玉波，刘仁沿，许道艳，刘磊，
申请(专利权)人：国家海洋环境监测中心，
类型：发明
国别省市：91
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