一种检测不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，包括样品的提取，纯化及检测，所述的样品加氯化钠后采用甲醇-水(90∶10，V/V)高速匀质提取，过滤，加水稀释，玻璃纤维膜过滤，免疫亲和柱净化后氮气吹干，加衍生化试剂80℃衍生化40min，4％碳酸氢钠水溶液萃取杂质，取上层有机相稀释进样。其中衍生化试剂的配置为：无水硫酸钠对甲苯-乙腈(95∶5，V/V)溶液进行脱水干燥，取七氟丁酰咪唑适量，按照1∶3的比例加入加甲苯-乙腈(95∶5，V/V)溶液制成溶液。所述样品测定方法包括：气相色谱-电子捕获检测法测定，用DB-1701毛细管色谱柱分离，程序升温，不分流进样；气-质谱联用法确证，用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，程序升温，不分流进样。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法，特别是涉及采用气相色谱-电子捕获检测法测定，气相色谱-质谱联用确证中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的方法。
技术介绍
单端孢霉烯族毒素是一类由镰刀菌属中多种真菌所产生的次生代谢产物，在自然界中分布极为广泛，是自然发生的最危险的食品污染物，对人畜健康危害十分严重。由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而且上述镰刀菌中部分为产毒菌，可产生单端孢霉烯族类毒素，因此，很有必要对中药中单端孢霉烯族毒素进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。单端孢霉烯族化合物分为二大类，A型和B型，其中A型毒性最大，研究得也最多， T-2和HT-2毒素就属于A型。T-2毒素是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种，HT-2毒素是T-2毒素的代谢产物。T-2毒素在多种谷物(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦)及其制品(麦芽、啤酒、面包)中广泛存在，其毒性强烈，至今已有3种地方病(食物中毒性白细胞缺乏症、大骨节病、克山病)的病因被认为与T-2毒素有关，对人畜构成很大危害。1973年联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源，尤其是美国指责前苏联、越南在东南亚使用“黄雨(yellow rain)”毒素(其中含有T_2毒素)以后，有关Τ_2，ΗΤ-2毒素对人类健康的危害引起了各国政府和科学家的较大关注。
技术实现思路
到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料中Τ-2，ΗΤ-2 毒素的分析，对中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素的分析，目前还是空白。因此对中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的Τ-2，ΗΤ-2毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本专利技术克服现有技术不足，选择了适用于中药中Τ-2，ΗΤ-2毒素的提取、净化方法，优化了气相，气质的色谱条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的Τ-2，ΗΤ-2毒素进行测定。本专利技术是通过采用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的Τ-2，ΗΤ-2毒素的方法，同事建立了不同基质中Τ-2，ΗΤ-2毒素的气相色谱-质谱联用确证法。具体的不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料仪器Agilent GC-6890N气相色谱仪、Ni电子捕获检测器，美国安捷伦公司；Agilent 768 系列自动进样器，美国安捷伦公司；Varian 431气相色谱仪，美国瓦里安公司；Varian 300三重四级杆质谱仪，美国瓦里安公司；TGL-16C型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；Waring高速均质器，美国Waring公司；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；PGG-OlD型干式氮吹仪，天津艾维欧科技发展有限公司DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司T-2&HT-2test-HPLC 免疫亲和柱，美国 VICAM 公司；GF/A型玻璃微纤维滤纸，英国WHATMAN公司。对照品T-2，HT_2毒素标准品购自美国Sigma公司，纯度彡99%;N-七氟丁酰咪唑(HFBI)， 美国Afla Aesar公司；正己烷为色谱纯，天津市光复精细化工研究所；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。样品所测样品分别购自江西樟树、陕西宝鸡、江苏镇江、北京以及贵州遵义，所有样品均为市场上随机购买而来，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定，低温干燥后备用。1、气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素a.色谱条件用毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气， 进样口温度260-280°C，检测器温度290-3KTC，程序升温，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别称取对照品适量，加乙腈或甲醇制成溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，加甲苯-乙腈溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量，加甲醇-水溶液适量，高速勻质提取，过滤，稀释，震摇，静置，再震摇，再静置，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至空气通过柱体，再以水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使空气通过柱体。甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂适量于上述吹干样品，密封，涡旋混合，放入烘箱中反应，冷却，加正己烷适量，摇勻，加碳酸氢钠水溶液适量，涡旋，离心 3-5min,取上层有机相，加正己烷定容。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱仪，测定。2、用气相色谱-质谱联用检测法确证中药中的A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用HP-5MS毛细管色谱柱分离，以氦气为载气，进样口温度 260-280°C，程序升温，不分流进样；b.质谱条件电子轰击离子源，离子源温度220_240°C，电离能量60_80eV，四级杆6温度140-160°C，传输线温度270-290°C，溶剂延迟5-15min，全扫描。c.分别精密吸取对照品和样品溶液，注入气相色谱-质谱联用仪，确证。上述的不同基质中药中两种A型单端孢霉烯族毒素的测定方法，优选以下步骤1、用气相色谱-电子捕获检测法测定中药中的两种A型单端孢霉烯族毒素；a.色谱条件用DB-1701毛细管色谱柱分离，电子捕获检测器检测，以氮气或氦气为载气，进样口温度260-2800C，检测器温度290-310°C，程序升温，初始温度80°C，保持 anin 后以 10°C /min 速率升至 200°C，再以 5°C /min 升至 220°C，再以 2°C /min 升至 230°C， 保持13min，再以3°C /min升至270°C，再以5°C /min升至280°C保持5min，不分流进样。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取HT-2和T-2毒素对照品适量，加乙腈或甲醇制成每ml含30-80 μ g的溶液；衍生化试剂的配制取七氟丁酰咪唑适量，按照1 3的比例加入加甲苯-乙腈 (90-96 :4-10, V/V)溶液制成溶液。c.样品溶液的制备样品提取精密取药材粉末20_30g，置具塞锥形瓶中，加氯化钠适量l_5g，加甲醇-水溶液(80-95 5-20，V/V)适量，高速勻质提取l-5min，过滤，取5_15ml滤液加水 20-60ml稀释，震摇l-2min，静置l-3min，再震摇l-2min，静置l-3min，玻璃纤维膜过滤，备用；样品净化取上述滤液5_15ml缓慢通过T-2&HT-2test-HPLC免疫亲和柱，直至 l-5ml空气通过柱体，再以10-15ml水淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使l_5ml空气通过柱体。加Iml甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，氮气吹干备用。衍生化加衍生化试剂50-100于上述吹干样品，密封，涡旋混合Ι-aiiin，放入烘箱中80°C反应，冷却，加正己烷，摇勻，加3-本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测不同基质中药中两种Ａ型单端孢霉烯族毒素的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：（１）用气相色谱－电子捕获检测法测定中药中的两种Ａ型单端孢霉烯族毒素；（２）用气相色谱－质谱联用检测法确证中药中的两种Ａ型单端孢霉烯族毒素；
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨美华，张晓飞，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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