一种阿霉素与膜联蛋白V偶联物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的膜联蛋白V及其变体分子与抗癌药物阿霉素的偶联、制备方法及应用，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺为交联剂与阿霉素偶联，以及制备可溶性偶联物的方法。制备的偶联物具有更好的抗肿瘤活性，为进一步研究靶向抗肿瘤药物及其应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，具体涉及阿霉素与膜联蛋白V的偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
阿霉素是一种蒽环类抗生素，用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等癌症，抗癌谱比较广。周密等人(Zhou，Μ.等人，2008，复旦学报*医药版，35:793-798)研究发现阿霉素是通过内源性的caspase-3途径诱导肝癌细胞凋亡。阿霉素对正常细胞也发生作用，造成很大的毒副作用，主要表现为心肌毒性、骨髓抑制和神经毒性。阿霉素对心肌组织的亲和力明显高于其他组织，造成心肌毒性。由于阿霉素对于肿瘤靶向性差、因此药物的副作用大。如何提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性成为阿霉素临床应用的一个重大难题。膜联蛋白V是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合，它具有抗凝及抗炎的作用。近年来还发现膜联蛋白V具有抗肿瘤的作用。在肿瘤生长的过程中，肿瘤细胞会产生表面富含磷脂酰丝氨酸的微泡，微泡中含有可以促进肿瘤血管新生的表皮生长因子受体等物质。膜联蛋白V通过阻止这些微泡与肿瘤血管上皮细胞的融合，从而抑制了肿瘤血管新生和肿瘤的生长。膜联蛋白V蛋白在体内可以与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合。
技术实现思路
为了提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤活性，本专利技术的目的在于提供一种提高阿霉素抗肿瘤活性的方法及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物上的应用。为达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种膜联蛋白V与阿霉素的偶联物，其中膜联蛋白V是指具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的野生型膜联蛋白V及其突变体或者截短体分子。上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，可以通过下述步骤进行(1)膜联蛋白V活化将膜联蛋白V溶解，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，EDC能够将含有羧基的分子和含有氨基的分子偶联，加入不同浓度Sulfo-NHS用以增强偶联效果。(2)活化反应中止加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。(3)浓缩中间产物用截留分子量为IOKD的超滤管离心浓缩中间产物溶液。(4)偶联反应将盐酸阿霉素饱和溶液与浓缩后的膜联蛋白V活化中间产物混合，室温搅拌反应。反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。(5)膜联蛋白V-阿霉素偶联物的溶解与纯化用含8M尿素的溶液溶解反应体系中产生的偶联物絮状沉淀，然后用0. 1 M磷酸钠溶液稀释产物溶液，并反复进行浓缩和重复稀释过程，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的检测方法，可以通过下述步骤进行偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定蛋白质含量，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算。将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，扫描范围为190 700 nm。上述制备的偶联物可以用以制备抗肿瘤药物。与已有的技术相比，本专利技术有以下有益效果(1)制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物利用了膜联蛋白V本身即具有抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长的活性、同时又能够与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合的性质，将阿霉素与膜联蛋白V偶联，通过增强阿霉素对肿瘤靶向性来达到增强阿霉素抗肿瘤活性的目的。利用该方法制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物1 μ M时，细胞存活率仅为27. 7%，而达到相同抑制率，阿霉素需要1.8 μ Μ。因此，所需偶联物的剂量仅为阿霉素的55. 6%。(2)在合成膜联蛋白V-阿霉素偶联物的反应过程中，除众所周知的偶联底物膜联蛋白V、阿霉素及偶联剂EDC的用量及其比例对于偶联物的得率具有很大影响外，N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的浓度也对偶联物产生较大的影响。如果Sulfo-NHS的终浓度为5 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0. 75 ；当将Sulfo-NHS的浓度提高到15 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为 1:1. 17。Sulfo-NHS的浓度也对偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的比例、也就是偶联物的效率和质量产生较大的影响。(3)建立了膜联蛋白V-阿霉素偶联物絮状沉淀的溶解与纯化方法。由于阿霉素的疏水性，偶联物在生成后会形成絮状沉淀，但是制备的药物在应用中则要求偶联物必须是溶解状态的。本专利技术通过采用含有8 mol/L尿素的溶液将偶联物溶解，再将溶液换为0. 1 M磷酸钠(pH=7. 5)溶液，偶联物可以在此溶液中稳定存在，并具有良好的生物活性，为偶联物的应用提供了便利条件。附图说明图1膜联蛋白V和阿霉素偶联物的紫外吸收光谱鉴定。1 偶联物吸收光谱；2 膜联蛋白V吸收光谱；3 阿霉素吸收光谱；4 滤过液吸收光谱。图2膜联蛋白V-阿霉素偶联物对MDA-MB-231细胞的杀伤作用。- ·-膜联蛋白V-阿霉素偶联物；一■一 膜联蛋白V ； - -阿霉素；一 A-膜联蛋白V与阿霉素混合物。具体实施例方式实施例1.活化Annexin V表面的羧基2 mg Annexin V冻干粉溶解于2 ml的0.05 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、0. 5 M NaCl，pH=6. 0溶液中，调节浓度至1 mg/ml，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，使其终浓度在6 mM。加入N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，使其终浓度在5福，混勻后室温反应15分钟，然后加入2.8 μ 1 2-巯基乙醇，浓度至20 mM，反应10分钟，以中和未反应的EDC。2.活化的Armexin V与阿霉素偶联用截留分子量为IOKD的超滤管离心浓缩中间产物溶液，尽量减少溶液体积，以降低对偶联反应缓冲液PH值的影响。将3 mg盐酸阿霉素加入0. IM磷酸钠溶液(pH=7. 5)中形成饱和溶液，再将超滤管浓缩的中间产物与阿霉素溶液混合，室温搅拌2小时。3.偶联产物的溶解反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。用含8 M尿素的 0. 1 M磷酸钠(pH=8. 0)溶液溶解。4.偶联产物的纯化使用0. 1 M磷酸钠(pH=7. 5)稀释产物溶液，进行超滤浓缩， 重复稀释-浓缩操作四次，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。5.偶联物的定量分析偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算，C阿霉素=A495AOOOO (mol/L)—1，其中10000 (mol/L)1Cm1为阿霉素在495nm处的摩尔吸光系数。6.偶联物的抗肿瘤活性分析取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成悬液，并稀释成IXlO4 细胞/ml备用。取96孔培养板，每孔加入200 μ 1细胞悬液(含2 X IO3细胞)。次日，为了模拟癌细胞在体内的状态，先用0. 2 mM的过氧化氢处理一小时，然后再加入不同浓度的偶联物、膜联蛋白V、阿霉素、以及阿霉素与膜联蛋白V的混合物，每一浓度重复做4孔。同时设无细胞组作为检测时的背景。置与相应的环境下培养72小时后，每孔加入25 μ MTT (5 mg/ml)，继续培养4小时。吸出上清，加入200 μ 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种膜联蛋白Ｖ与阿霉素偶联物，其特征是将膜联蛋白Ｖ的羧基与阿霉素的氨基通过小分子交联剂偶联，其中膜联蛋白Ｖ是指具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的野生型膜联蛋白Ｖ及其突变体或者截短体分子。

【技术特征摘要】
1.一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物，其特征是将膜联蛋白V的羧基与阿霉素的氨基通过小分子交联剂偶联，其中膜联蛋白V是指具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的野生型膜联蛋白V及其突变体或者截短体分子。2.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物的偶联方法，其特征是将膜联蛋白V先后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，然后加入阿霉素溶液进行反应，再加入2-巯基乙醇中和未反应的交联剂，终止偶联反应。3.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，谢德，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84