一种针对T细胞受体可变区特异性单抗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种针对T细胞受体可变区特异性单抗的制备方法，首先制备可溶性T细胞受体蛋白，然后采用正反筛选获得可产特异性可变区单抗的杂交瘤株。应用本方法可以高效、快速的获得T细胞受体可变区特异性单抗，对设计和开发基于T细胞的相关疫苗和免疫治疗手段具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种单克隆抗体的制备方法，尤其是一种通过正反筛选法获得特异性单克隆抗体的方法。
技术介绍
T细胞通过其表面T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别主要组织相容性复合物分子(Major histocompatibility complex, MHC)呈递的多肽来行使其细胞功能，所以 TCR的识别能力是T细胞行使功能的先决条件。与抗体分子一样，TCR组成链的形成也存在基因重排现象，即每条多肽链的编码基因都是由3个或4个基因片段组合而成。其中，短链 α和Y是由可变区基因片段(V gene segment)、连接子基因片段(J gene segment)和恒定区基因片段(C gene segment)三种片段连接而成，而长链β和δ是由4个基因片段组合而成，包括与短链一样的3个基因片段和额外的多样性基因片段(D gene segment)。每个基因片段的相互连接处都存在核苷酸的随机缺失或增加，从而造成连接处的高度多样性。举例而言，人染色体上共含有42个Va基因片段和46个νβ基因片段，以及数目庞大的连接子基因片段J α或J0，加上基因重排时基因片段连接处的高度多样性，就使得α β TCR库的数目高达IOw个。我们知道，对于其他类型的细胞受体而言，没有一种细胞受体能和TCR 一样具有如此多的多样性。所以我们可以想象，TCR与其配体之间的识别将比其他任何一种细胞受体都要复杂和奇妙。TCR主要通过其可变区的6个互补决定区域(Complementarity determining region,⑶R)来与配体发生相互作用，所以可变区决定TCR的识别能力。而在病原抗原特异性或肿瘤抗原特异性的T细胞受体库研究中，我们往往会发现某些可变区基因片段会占优势，存在偏好性，而监测这些带有优势可变区基因片段的T细胞受体的变化情况对于我们设计和开发基于T细胞的相关疫苗和免疫治疗手段具有重要的意义。目前成熟应用的监测方法就是流式细胞仪技术，而要想应用流式细胞仪技术必然需要用到特异性的单克隆抗体。但是到目前为止，依然没有一种通用的方法来生产针对T细胞受体可变区特异性单克隆抗体的制备方法，本专利旨在提供一种能够有效生产该类单克隆抗体的方法，并申请保护。本专利技术通过体外复性技术获得可溶性T细胞受体蛋白，接着应用单克隆抗体杂交瘤技术生产单抗，并采用正反筛选法来获得某可变区特异性的单抗。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种针对T细胞受体可变区特异性单抗的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为首先制备可溶性T细胞受体蛋白，然后采用正反筛选获得可产特异性可变区单抗的杂交瘤株。所述可溶性T细胞受体蛋白制备过程中通过引入人工二硫键稳定T细胞受体蛋白，所述人工二硫键由α链恒定区的Τ48 - C和β链恒定区的S57 _ C组成。为了更好的稳定T细胞受体蛋白，可同时将β链中的自由半胱氨酸突变成丙氨所述正反筛选的原理如下T细胞受体胞外段由4个免疫球蛋白结构域组成，包括两个可变区和两个恒定区。所以当我们采用T细胞受体蛋白去免疫小鼠生产单抗时，我们得到的单抗有可能结合目标可变区外的其它三个结构域。为了高效获得目标可变区特异性的单抗，我们还要采用反筛法剔除那些不结合目标可变区的单抗。其具体步骤如下首先利用T细胞受体蛋白1免疫小鼠生产单抗，将能够结合T细胞受体1的单抗杂交瘤株留下；然后使用τ细胞受体2筛选将第1)步获得的单抗杂交瘤株，将不能结合T细胞受体2的单抗杂交瘤株留下，得到可产特异性可变区1单抗的杂交瘤株；所述T细胞受体1与T细胞受体2的区别就在于目标可变区的不同，而其它三个结构域都相同。应用本方法可以高效、快速的获得T细胞受体可变区特异性单抗，对设计和开发基于T细胞的相关疫苗和免疫治疗手段具有重要的意义。附图说明图1单克隆抗体检测。 具体实施例方式实施例1可溶性T细胞受体蛋白改造以筛选V δ 1可变区(也叫TRDV1，TCR可变区信息请参考网站http://www. imgt. org) 的特异性单抗为例，我们来说明具体的实施方式。其中，我们用于正筛的T细胞受体1为 S19-2，来源于HIV病人，识别的配体是HLA-AM402限制性的nef 138-10表位(来源于HIV 病毒nef蛋白)。所有蛋白材料可由基因合成公司合成相应基因来表达。HLA-A*2402的序列信息如SEQ ID NO. 1所示，具体如下 GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQTDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEA AHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCffALGFYPAEITLTffQRDGEDQTQ DTELVETRPA⑶GTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWNefl38-10表位多肽可由公司合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具体如下 为 RYPLTFGWCF。S19-2 TCR 两条链的基因组成信息为α 链，TRDVl+TRAC ； β 链，TRBV30+TRBC。α链蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示，具体如下 MLFSSLLCVFVAFSySGSSVAQMTQAQSSYSMPYRMYTWCLYETSmSYYIFmmiPSKEMIFLmQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGELARSGGYQKVTFGTGTKLQVIPAyaV/ K7^ RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAVSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFP ^^CDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLffSS其中，带有下划线的部分为可变区序列，带有下划线且斜体字体部分为恒定区序列，位于可变区和恒定区之间的为高度可变的连接区序列。恒定区序列中的T48突变成C，用于后期的复性过程中可引入一对人工二硫键来稳定TCR蛋白的构象。β链蛋白序列如SEQ ID NO. 4所示，具体如下MLRSLLALLLGTFFGVRSQTIHQffPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYffYRQAAGRGLQLLFYSVGIG QISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSVSVGAGVPTIYFGEGSWLTVWi^MT/y/^^K/^ PSEAEISHTOKA TL VCLA TGFFPDHVELSVVVNGKEVHSGVSTDPOPLKEOPALNDSRYCLSSRLRVSA TFVONPR mFffCOVOFyGLSBMIBWWDMKPVWIVSABAWGMDCGFTSYSYQQGYLSATILYEILLGMTLYAYUSAU LMAMVKRKDF其中，带有下划线的部分为可变区序列，带有下划线且斜体字体部分为恒定区序列， 位于可本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种针对Ｔ细胞受体可变区特异性单抗的制备方法，其特征在于首先制备可溶性Ｔ细胞受体蛋白，然后采用正反筛选获得可产特异性可变区单抗的杂交瘤株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高福，施一，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11