本发明专利技术提供了一种高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，包括将形成圆环病毒空衣壳所需的不同病毒株系的抗原基因cap、人工改造的cap的突变体克隆到家蚕杆状病毒运载载体中获得同源重组载体，将同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或菌中进行重组或转座获得重组杆状病毒，用含抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫；培养被感染的昆虫宿主表达相应的圆环病毒2型空衣壳粒子，经过比较和实验确定病毒空衣壳颗粒高效组装所需的信息，获得可高效表达和组装病毒空衣壳颗粒的重组病毒株系，以大量生产圆环病毒2型空衣壳颗粒，将上述方法生产的猪圆环病毒2型空衣壳颗粒进行初步纯化就可用于制备防治猪圆环病毒病的疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用真核生物表达体系制备圆环病毒空衣壳粒子的方法，尤其涉及到利用重组杆状病毒在昆虫体内高效表达抗原基因或人工改造的抗原基因以及组装病毒空衣壳粒子的方法，用于制备预防猪圆环病毒病基因工程疫苗，属于基因工程和兽用生物制品领域。
技术介绍
1.猪圆环病毒病概述猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS)等相关疾病的主要病原。是一种无包膜的二十四面体，单链环状DNA病毒，基因组全长为1 767bp或1 768bp，包含11 个阅读框架，但是，有明确的编码产物的只有其中的两个，rep和cap。猪圆环病毒分为两个血清型，PCVl和PCV2。最早的PCV在猪肾传代细胞H(15中作为一个小核糖核酸病毒污染物被发现。当时未引起重视，后来发现一种新的PCV能够在全球范围内引起猪一系列临床病症，PCV才被重视起来。新的PCV被命名为PCV2，而原来发现的称为PCVl。目前，尚未发现PCVl有病原性。PCVl和PCV2的基因组分别为1759bp、1768bp，两者都编码两个主要蛋白r印(复制相关蛋白)和cap (核衣壳蛋白)。由于PCVl尚无明确的致病证据，现在研究的主要对象还是PCV2。目前为止，在NCBI上注册，有完整基因组的PCV2的病毒株，包括重组的病毒已经达到了 553株。PCV2流行广泛，德国某些猪群中血清阳性率高达77% 95%，加拿大猪血清中的阳性率在沈％ 55%，英国为86%，爱尔兰达92% (刘丽霞，猪圆环病毒研究进展.畜牧兽医杂志，2007 (02).)。在我国，郎洪武等从7个省(市)22个猪群采集各类猪血清样品559 份，通过ELISA检测发现后备母猪阳性率为43. 3% (61/141)，经产母猪阳性率为85.6% (107/125)，肥猪阳性率为5 1.0% (49/96)，559头猪总阳性率为42. 9% (MO/559)(郎洪武等，断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000 (03).)。PCV2的死亡率10% 30% (杨顺利等，猪圆环病毒2型致病机制研究进展.畜牧与兽医，2009(11).)。 因此，PCV2能够给养猪业带来巨大损失。2.猪圆环病毒病疫苗研制目前，在商业上得到应用并且在一些欧美国家获得应用许可的疫苗均为含有佐剂的灭活PCV2疫苗，主要有以下几种(1)以PCVl为骨架，用PCV2的0RF2置换PCVl的0RF2 部分，构建嵌合病毒制备活疫苗。0)PCV2全病毒灭活疫苗。( 表达PCV2的0RF2的亚单位疫苗。这类疫苗存在缺陷，主要表现在1、灭活不彻底，造成受免动物感染和散毒；2、用细胞培养的方法获得的病毒抗原含量低，增加了生产成本，达不到良好的免疫效果。为此， 在猪圆环病毒基因工程疫苗研究中，大肠埃希菌、减毒的伪狂犬病病毒活病毒载体、重组腺病毒等均被用来安全生产猪圆环病毒2抗原(隋慧等，猪圆环病毒2型疫苗研究进展动物医学进展，2007年12期)。但均无法达到大幅度提高猪圆环病毒抗原产量的目的。3.猪圆环病毒分子生物学特征血清学实验显示，ORFl在PCVl和PCV2之间具有交叉反应性，而0RF2却是特异的 (Mahe et al. , Differential recognition of 0RF2 protein from type 1 and type 2 porcinecircoviruses and identification of immunorelevant epitopes. J Gen Virol, 2000. 81 (Pt 7) :p. 1815- )，两种血清型的0RF2编码的蛋白没有抗原交叉反应，所以亚单位疫苗一般都选择0RF2。0RF2的N端含有一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear locationsignal, NLS)。这个信号肽由于密码子偏爱性的原因，致使在细菌中表达量很低 (Nawagitgulet al. , Modified indirect porcine circovirus(PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV. ClinDiagn Lab Immunol,2002.9 (1) :p. 33-40)。去除NSL是否影响0RF2的免疫原性，这对做疫苗的表达研究是很重要的问题。Porntippa Lekcharoensuk等连续删除PCV2的0RF2的序列，并在删除的区段用PCVl的相应的区段来填补，构建DNA的嵌合体，表达这个嵌合体，最后用筛选的PCV2特异的7个单克隆抗体来对表达产物进行检测。结果发现在0RF2的47 63残基，165 200残基， 及C端的四个残基中，存在至少5个不同但是部分重叠的肽段，被7个单克隆抗体识别 (Lekcharoensuk et al. Epitope mapping of the major capsid proteinof type 2 porcine circovirus(PCV2)by using chimeric PCVl and PCV2. J Virol,2004. 78(15) p. 8135-45)。而C. Truong等用 SPF仔猪(specific pathogen-free piglets)及普通农场的猪为材料，利用酶联免疫(ELISA)的方法，找到在PCV2中的0RF2中，69 83残基及117 131 残基是 PCV2 的特异免疫位点(Truong et al. ,Identification of an immunore levant 0RF2 epitopefrom porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection. Arch Virol,2001. 146(6) :p. 1197-211.)。Mahe 等通过多肽扫描(PEPSCAN)预测并经过免疫实验验证发现67 87残基，113 139残基， 193 207残基为PCV2的3个型特异性的抗原位点，25 43的残基仅和来自SPF仔猪的血清发生反应(Mahe et al. 2000)。综上所述，认为去除NSL不会明显减低PCV2的免疫原性，作为疫苗对普通饲养的猪没有任何影响。而在细菌中表达去除NSL后的0RF2，蛋白的表达含量明显增高，且具有免疫原性(Wang et al. ,The activation of lytic replication of Epstein-Barr virus by baculovirus-mediated genetransduction. Arch Virol, 2006. 151(10) :p. 2047-53.；本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．高效制备猪圆环病毒２型空衣壳颗粒的方法，其特征在于该方法主要包括：将形成圆环病毒２型空衣壳所需的不同病毒株的抗原基因ｃａｐ、人工改造的ｃａｐ的突变体克隆到家蚕杆状病毒运载载体得同源重组载体，将同源重组载体与亲本病毒ＤＮＡ在昆虫细胞或大肠杆菌中进行重组或转座得重组杆状病毒，用含抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫；培养被感染的昆虫宿主表达相应的圆环病毒２型空衣壳粒子；收集并纯化表达产物可得上述猪圆环病毒２型空衣壳颗粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郎洪武，张志芳，李轶女，陈晓春，易咏竹，高金源，丁农，吴华伟，邓永，韦永龙，边大勇，杨标，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11
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