本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，首先分离广西尖吻蝮蛇毒腺组织，构建噬菌体展示文库，以纤维蛋白/纤维蛋白原为底物，经过三轮淘选，获得了一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因。本发明专利技术还构建了尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的原核表达载体pET-32(a)-TLE，诱导表达、亲和纯化和分子筛纯化后，获得了具有生物学活性的重组蛇毒类凝血酶蛋白。该酶可用于制备心血管溶栓药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及。
技术介绍
心脑血管疾病如脑中风、冠心病以及外周血管血栓等严重影响人们生活质量、并造成沉重经济负担。作为自然界的野生资源之一，毒蛇毒液中含有许多生物活性多肽和蛋白质，包括对机体循环系统有重要影响的组分。利用蛇毒研制开发新的治疗血栓的药物，成为国内外研究的热点之一。基于天然蛇毒资源以及产品纯度方面的限制，单纯依靠改进工艺已经不能满足需要，而通过现代基因工程技术可获得大量的蛇毒重组蛋白，这也符合现代生物药物的发展趋势。同时随着地区城市化及农村经济的发展，蛇类栖息地受到越来越多的破坏，有些蛇类也许在我们获得其基因信息之前就灭绝了。利用宝贵的蛇毒资源造福人类，是具有广泛应用前景。在蝰亚科、蝮亚科等蛇类蛇毒中含有能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原的酶，如纤维蛋白(原)溶酶(简称纤溶酶)(Fibrinolytic enzyme)、类凝血酶(Thrombin-Iike enzyme)。纤溶酶可以作用于纤维蛋白和纤维蛋白原的A α和Ββ亚基，将纤维蛋白和纤维蛋白原水解成片段而可起到抗凝、溶栓作用。类凝血酶可以水解纤维蛋白原的A链或 B链，且不激活XIII因子，因此产生了非交联的可溶性纤维蛋白单体，使其不能形成血栓， 同时可以大量消耗纤维蛋白原而达到抗凝效果。临床上已经应用的类凝血酶有Ancrod、 Crotalase λ Batroxb in λ Flavoxob in λ Bothromb in 及 Defibrase 等。有的类凝血酶除有抗凝血活性外还有其它活性如出血活性、神经毒性等。研究表明蝮蛇纤溶酶和类凝血酶是一组蛋白水解酶的混合体。由于各种抗凝组分的理化性质比较接近，给分离提纯工作带来一定的困难。目前对蛇毒蛋白的分离纯化方法是利用色谱技术获得单一组分，然后通过不同的生化实验来确定所得蛋白组分的生物学特性。抛开烦琐的蛋白质纯化不言，就是确定所得蛋白的生化特性也颇为困难。因此有必要应用基因工程方法，来获得具有重要生物活性的蛇毒蛋白。
技术实现思路
为了实现上述目的，本专利技术提供一种利用生物工程方法制备出具有活性的蛇毒类凝血酶。本专利技术提供了上述方法制备的类凝血酶蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供，包括如下步骤1)制备蛇毒类凝血酶基因；所述的蛇毒类凝血酶基因如SEQ ID NO=I所示；2)将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；3)用原核表达载体转化大肠杆菌；4)挑取含表达载体的单克隆菌株在37°C下过夜振荡培养至A600 = 0. 6-0. 8，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0. 7mmol/L，18°C振荡培养8小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；5)收集菌体，-80°c冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅勻，冰上超声破菌；6)在4°C，SOOOg下离心10分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。所述的蛇毒类凝血酶基因是通过下述方法获得的a)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离m RNA,反转录获得 cDNA ；b)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位占.c)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；d)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体将纤维蛋白原稀释至浓度为 10 μ g/ml，用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体 100 μ 1，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；e)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4为引物，PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因。本专利技术提供的技术方案具有如下的优点1.传统cDNA文库以带有PolyA的mRNA为模板，反转录合成cDNA第一条链。cDNA 第二条链合成可通过自身引导法或置换合成法或引导合成法，通过分级分离去除小分子 dscDNA并对其进行修饰，切平端，接上接头或衔接头，磷酸化后，克隆到能在细菌中扩增的载体中。随着分子生物学的发展，cDNA文库的构建方法有了很大的改进。但传统cDNA文库仍存在不足第一，低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，因此，要想得到低丰度表达基因，至少要筛选106克隆；第二，构建传统cDNA文库所需的mRNA量大，达数微克第三， 筛选传统cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度。基于上述原因我们选择了 T7噬菌体cDNA文库，T7噬菌体比传统的Ml3噬菌体更为有效、便利，使噬菌体展示所用的载体得到了扩展，而且已经得到了很好的应用，与传统的M13相比，T7克服了丝状噬菌体只能通过穿膜分泌展示蛋白的局限性，使文库的信息量更大，同时具有噬菌体稳定性好、筛选周期短等优点。T7能够展示低拷贝数(0. 1-1拷贝每一个噬菌体)的、大片段的、最长1200个氨基酸的肽或蛋白，也可以展示高拷贝数015拷贝每一个噬菌体)大小为50个氨基酸的肽或蛋白。T7能够比丝状噬菌体或者λ噬菌体更容易生长、复制。在感染到宿主菌1-2小时后就能够形成培养物溶解，37°C 3小时内形成噬菌斑，T7能够在很艰难的环境下生长，因而扩大了在下一步筛选的过程中可以使用的试剂成分，在噬菌体肽库中，由于呈现在噬菌体表面的多肽已经事先与某种外壳蛋白的N端连接，因而可以在预先不知道多肽结构的情况下，利用ELISA等技术检测噬菌体与靶分子的亲和力，从包含上亿种噬菌体的肽库内进行高效筛选同时富集特异的融合型多肽。筛选出的噬菌体克隆可通过再次感染细菌得到扩增，所呈现多肽的相应结构和功能信息，可以通过对阳性噬菌体克隆的DNA测序获得。本专利技术首次构建了尖吻蝮蛇毒腺的T7噬菌体展示文库，建立了以纤维蛋白原为底物来筛选蛇毒毒腺T7噬菌体展示文库的淘选方法，经过三轮亲和淘选，得到了一个新的类凝血酶基因，测序鉴定，BLAST同源性搜索，结果发现与已知的类凝血酶家族核酸与氨基酸序列相似程度很高，GenBank登陆号AY861138. 1。此类凝血酶有完整的开放阅读框和终止密码子，编码260个氨基酸。2.类凝血酶融合表达后怎样纯化蛋白是现有技术中存在的问题，很多文献中得到的蛋白是以包涵体形式存在，再经纯化、酶切、重折叠等，蛋白的活性会大大下降。本专利技术用融合表达，而且是上清表达的方式得到了重组类凝血酶蛋白。我们构建了 pET-32 (a) -TLE原核表达系统，在克隆时保留N端 χ-Tag和6个His-Tag两个标签，之后在克隆位点插入蛇毒类凝血酶基因(TLE基因)并在其3端加入终止密码子。转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE;3)pLysE，经IPTG诱导，18°C下表达(区别于其他表达系统温度)，全菌破菌后发现重组类凝血酶表达量达到30%以上，运用HPLC等方法纯化得到了纯度95%以上的重组类凝血酶，通过重组类凝血酶的生物学功能检测实验发现其具有很好的生物学活性。附图说明图1 尖吻本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（１）制备蛇毒类凝血酶基因：ａ）小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织ＲＮＡ，并进一步提取分离ｍＲＮＡ，反转录获得ｃＤＮＡ；ｂ）ｃＤＮＡ双链进行末端补平，补平后的ｃＤＮＡ末端加上ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切位点；ｃ）已加酶切位点的ｃＤＮＡ双链片段用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ限制性内切酶酶切，酶切片段连入Ｔ７载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；ｄ）以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体：将纤维蛋白原稀释至浓度为１０μｇ／ｍｌ，用封闭液将其包被在ＥＬＩＳＡ板上；包被好的ＥＬＩＳＡ板，每孔加入包装好的噬菌体１００μｌ，室温孵育２小时；用ＴＢＳＴ溶液洗板５次，加洗脱液在室温孵育２０分钟，从ＥＬＩＳＡ板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；ｅ）从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４为引物，ＰＣＲ扩增获得蛇毒类凝血酶基因，如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示；（２）将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；（３）用原核表达载体转化大肠杆菌；（４）挑取含表达载体的单克隆菌株在３７℃下过夜振荡培养至Ａ６００＝０．６－０．８，加异丙基－β－Ｄ－硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为０．７ｍｍｏｌ／Ｌ，１８℃振荡培养８小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；（５）收集菌体，－８０℃冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅匀，冰上超声破菌；（６）在４℃，８０００ｇ下离心１０分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆一鸣，王俊杰，胡振林，王凯慧，魏玉保，孙树汉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31
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