本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及利用基因敲除手段敲除酿酒酵母氧化损伤清除基因，构建突变率可控的酿酒酵母致突变菌株。利用基因敲除技术敲除酿酒酵母RDKY3615氧化氢酶CTT基因ctt1得到酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔCTT)，敲除掉超氧化物歧化酶SOD的基因sod1得到酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔSOD)。通过控制外加氧化性物质双氧水的浓度和处理的时间，可以使RDKY3615(ΔCTT)、RDKY3615(ΔSOD)致突变菌株的突变率相对野生型菌株提高50～20000倍范围内，实现可控突变。本发明专利技术构建的酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔCTT)及RDKY3615(ΔSOD)为广泛的蛋白质体内定向进化提供了一个可控的操作平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及利用分子生物学技术敲除酿酒酵母氧 化损伤清除基因，构建突变率可控的酿酒酵母致突变菌株。
技术介绍
目前致突变菌株的研究已经越来越受到关注和重视，其主要应用就是在蛋白质的 体内定向进化上。原核生物的致突变菌株研究得已经较为成熟和深入，在蛋白质的体内定 向进化上也得到广泛的应用。商品化致突变菌株XLl Red Competent cell (stratagene公 司)的突变率大约为野生型菌株自发突变率的5000倍，作为原核表达系统其缺陷在于无法 有效的表达一些源于真核生物的蛋白质，该致突变菌株的另一不足是突变率不可控制。出 于上述原因，需要构建真核生物的致突变菌株，以应用在突变率可控的真核蛋白质的体内 定向进化上。酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)含有过氧化氢酶CTT、超氧化物歧化酶 S0D，这两个酶的作用是可以清除体内的氧化性物质，从而减少DNA的氧化损伤。当敲除过 氧化氢酶CTT基因cttl，超氧化物歧化酶SOD基因sodl后，在培养过程中，缺失了基因的致 突变菌株无法有效清除氧化性物质，其遗传物质将受到相对野生型更多的氧化损伤，当外 源DNA转入致突变菌株中时，宿主基因组和外源DNA可以同时发生随机突变，实现致突变菌 株和外源蛋白的协同进化。通过外加氧化性诱导剂控制致突变菌株的突变率，实现可控的 蛋白质体内定向进化。
技术实现思路
本专利技术旨在通过分子生物学手段，利用基因敲除技术分别敲除掉过氧化氢酶CTT 基因cttl、超氧化物歧化酶SOD的基因sodl，以获得突变率可控的致突变菌株，应用在蛋白 质体内定向进化上。本专利技术所述的酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 ( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)如下以trpl基因为标记基因，设计引物时在trpl基因两端分别引入待敲除基因ctt、 sod基因的同源序列，通过PCR扩增得到以trpl基因为标记基因，含有待敲除基因ctt或 sod的同源序列的敲除片断。该敲除片断纯化转化酿酒酵母RDKY3615 (ura3-52, trpl Δ 63， leu2 △ 1，his3 △ 200)，转化采用常规的电转化方法进行，然后在不含色氨酸的选择平板上 筛选阳性转化子。阳性转化子扩增培养后，提取基因组，进一步通过PCR扩增trpl基因的 结果确认。确定酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 (ACTT)及RDKY3615 ( Δ S0D)在外加氧化性 物质调控下的突变率。双氧水浓度的浓度范围0. 5mM 10mM，利用双氧水处理的时间范围 0 lh。本专利技术利用基因敲除技术分别敲除掉过氧化氢酶CTT基因cttl、超氧化物歧化 酶SOD的基因sodl，得到酿酒酵母致突变菌株。酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 ( Δ CTT)及RDKY3615 (ASOD)可以在双氧水等氧化性物质的调控下在一定的突变率内发生突变。酿酒 酵母致突变菌株RDKY3615(ACTT)及RDKY3615(AS0D)为广泛的蛋白质体内定向进化提供 了一个可控的操作平台。具体实施例方式以下将将结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，目的在于帮助读者更好的理 解本专利技术的精神实质，但不作为对本专利技术实施范围的限定。实施例设计引物在trpl基因两端分别引入待敲除氧化氢酶CTT基因cttl的同源序 列。通过PCR扩增得到以trpl基因为标记基因，含有待敲除基因cttl的同源序列的敲 除片断。该敲除片断利用PCR产物纯化试剂盒纯化后转化酿酒酵母RDKY3615(ura3-52， trpl Δ 63，leu2 Δ 1，his3 Δ 200)，转化采用常规的电转化方法进行，然后在不含色氨酸的选 择平板上筛选阳性转化子。阳性转化子扩增培养后，提取基因组，进一步通过PCR扩增trpl 基因的结果验证确认。验证正确的转化子命名为酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 (ACTT)。 RDKY3615 ( Δ CTT)酿酒酵母致突变菌株的突变率可控，实验数据表明通过控制外加氧化性 物质双氧水的浓度和处理的时间，可以使致突变菌株RDKY3615 ( Δ CTT)的突变率相对野生 型菌株可提高50 20000倍范围内。权利要求1.酿酒酵母致突变菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除酿酒 酵母清除体内氧化性物质相关的关键性酶的基因，并利用氧化性物质控制致突变菌株的突变率。2.酿酒酵母致突变菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除掉过 氧化氢酶CTT基因ctt 1，获得酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 ( Δ CTT)。3.酿酒酵母致突变菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，敲除掉超 氧化物歧化酶SOD的基因sodl，获得酿酒酵母致突变菌株RDKY3615 ( Δ SOD)。4.酿酒酵母致突变菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，利用氧化 性物质双氧水控制致突变菌株的突变率。5.酿酒酵母致突变菌株RDKY3615( Δ CTT)及RDKY3615 ( Δ SOD)，其特征在于，双氧水的 浓度范围0. 5mM 10mM，双氧水的处理时间O lh。全文摘要本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及利用基因敲除手段敲除酿酒酵母氧化损伤清除基因，构建突变率可控的酿酒酵母致突变菌株。利用基因敲除技术敲除酿酒酵母RDKY3615氧化氢酶CTT基因ctt1得到酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔCTT)，敲除掉超氧化物歧化酶SOD的基因sod1得到酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔSOD)。通过控制外加氧化性物质双氧水的浓度和处理的时间，可以使RDKY3615(ΔCTT)、RDKY3615(ΔSOD)致突变菌株的突变率相对野生型菌株提高50～20000倍范围内，实现可控突变。本专利技术构建的酿酒酵母致突变菌株RDKY3615(ΔCTT)及RDKY3615(ΔSOD)为广泛的蛋白质体内定向进化提供了一个可控的操作平台。文档编号C12N15/09GK102120965SQ201010033619公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月7日 优先权日2010年1月7日专利技术者伍国超, 刘巍峰, 庄国强, 马安周, 魏联果 申请人:中国科学院生态环境研究中心本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．酿酒酵母致突变菌株ＲＤＫＹ３６１５（ΔＣＴＴ）及ＲＤＫＹ３６１５（ΔＳＯＤ），其特征在于，敲除酿酒酵母清除体内氧化性物质相关的关键性酶的基因，并利用氧化性物质控制致突变菌株的突变率。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庄国强，刘巍峰，魏联果，伍国超，马安周，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：11
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