本发明专利技术属于寄生虫分子检测技术领域，涉及一种土壤中弓形虫的分子检测方法，尤其涉及一种利用环介导的等温扩增(LAMP)技术快速检测土壤环境中弓形虫卵囊的方法。本发明专利技术的特征是，通过设计一套弓形虫的特异性引物，提取被检土壤样品中总DNA，LAMP扩增，采用显色方法或琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行鉴定分析，判定所述样品中弓形虫是否为阳性或阴性。本发明专利技术的另一特点是在所述的LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了土壤环境中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率。本发明专利技术能快速、准确地将被检土壤样品中的弓形虫检测出来，同时适用于动物弓形虫感染的检测以及环境中弓形虫的监测。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种土壤中弓形虫的分子检测方法，其特征在于，通过设计弓形虫特异引物对，提取被检土壤样品总ＤＮＡ，采用环介导的等温扩增，对扩增产物进行分析以判定待测土壤样品中所述弓形虫是否为阳性或阴性，其步骤如下： （１）根据报道的登录号为ＥＵ５７２７１８的弓形虫ＭＩＣ３基因序列设计特异引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示： 外引物对Ｆ３：５’－ＴＡＧＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴＣＧ－３’； 外引物对Ｂ３：５’－ＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡＡＧＣＴＣＣ－３’； 内引物℃作用５ｍｉｎ后终止反应； ３）扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，所述的显色反应的步骤为：加入１－２μＬ的荧光显色剂１０００×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ至２５μＬ的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果；所述的琼脂糖凝胶电泳步骤为：取２５μＬ的环介导等温扩增的最终反应产物１０μＬ，加入至含有０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭染料的２％的琼脂糖凝胶中，于１００Ｖ电压下电泳３０ｍｉｎ，在凝胶成相系统上成像观察结果； 其中 步骤（３）的１）中的裂解缓冲液的组分及配比为：ｐＨ为８．０的５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ，１％十二烷基硫酸钠，补足双蒸水至１Ｌ。 步骤（３）的３）中ＤＮＡ提取液的组分及配比为：ｐＨ为８．０的５０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ，补足双蒸水至１Ｌ。对ＢＩＰ：５’－ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴ－３’； 内引物对ＦＩＰ：５’－ＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴ－３’； 促环形成引物对ＬＦ：５’－ＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＴＣ－３’； 促环形成引物对ＢＦ：５’－ＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣ－３’； （２）待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合并自然晾干，过２０目分析筛，去除土壤中的石头及杂草； （３）待检土壤样品中ＤＮＡ的提取： １）将处理过的０．５ｇ的土壤与０．５ｇ的直径为０．５ｍｍ的玻璃珠混合加入ｐＨ为８．０的２ｍＬ裂解缓冲液涡旋３ｍｉｎ直至土壤样品被打散，在７０℃下水浴１ｈ； ２）将步骤１）的土壤样品在５０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，保留上清备用； ３）将步骤２）的沉淀用ＤＮＡ提取液洗一次，于１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，并将得到的沉淀溶于１．５ｍＬ的ＤＮＡ提取液中，得到混合物； ４）将步骤３）的混合物分别置于－２０℃及６５℃下水浴，循环３次，于１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ后取清并与步骤２）的上清合并； ５）用体积比为２５∶２４∶１的等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提２次，取水相加等体积的异丙醇沉淀； ６）将步骤５）的样品在１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，用１００μＬ灭菌水溶解沉淀； ７）用ＤＮＡ纯化柱纯化ＤＮＡ样品。 （４）环介导的等温扩增： １）建立环介导的等温扩增反应体系：２．５μＬ １０×ＢｓｔＤＮＡ聚合酶缓冲液，７．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ↓［２］，１．０ｎｇ／μＬ牛血清白蛋白，１ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱，１．４ｍｍｏｌ／Ｌ脱氧核苷酸，０．３μｍｏｌ／Ｌ的引物Ｆ３和引物Ｂ３，１．６μｍｏｌ／Ｌ的引物ＦＩＰ和引物ＢＩＰ，０．８μｍｏｌ／Ｌ的引物ＬＦ和引物ＬＢ，８Ｕ的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶，２μＬ ＤＮＡ模板，灭菌双蒸水补齐至２５μＬ，其中阳性对照为土壤中提取的弓形虫ＤＮＡ，阴性对照为灭菌双蒸水； ２）环介导的等温扩增条件：９５℃预变性５ｍｉｎ后加入８Ｕ的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于６３．５℃反应５０ｍｉｎ，然后８０...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜芬，赵俊龙，周艳琴，聂浩，涂攀，张庆丽，李法财，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83
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