本发明专利技术为由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，提高重组载体对肿瘤细胞的钉伤功能。构建方法如下所述：①提取Survivin启动子基因，②提取人的细胞基因mRNA，反转录为cDNA，③在cDNA中扩增第一目的基因，④在cDNA中扩增第二目的基因，⑤将内切酶切开的Survivin启动子基因片断与基本载体分子用连接酶连接成第一中间载体，将内切酶切开的第一目的基因片断与第一中间载体分子用连接酶连接成第二中间载体，将内切酶切开的第二目的基因片断与第二中间载体分子用连接酶连接成第三中间载体，将用内切酶切开的IRES基因片断和第三中间载体用连接酶连接成重组载体，⑥将重组载体转染受体细胞，培养转染后的细胞，使重组载体分子随受体细胞扩增，筛选出含有重组载体分子的受体细胞。提取重组载体，检测其杀伤肿瘤细胞的能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生命科学领域，具体涉及一种选择性地在肿瘤细胞内增殖、而在正常 细胞内基本不增殖、并在肿瘤细胞高效表达抗癌基因的基因序列，及其构建的方法。以及这 类基因序列对肿瘤的杀伤作用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危及生物体生命健康的疾病，目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手 术及放、化疗。但常规治疗对大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于大多数化疗药物而言， 其治疗剂量与毒性剂量较为接近，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也造成损害，对机体 具有较大毒性，包括危及生命的骨髓抑制、肝肾功能受损等。特异性因此，研究选择性杀伤 肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要。人体免疫系统在应对肿瘤过程中发挥重要作用。杀伤性T细胞(CTL)对肿瘤的生 长起着重要的抑制作用，已有研究在临床中应用CTL细胞抑制肿瘤细胞增殖。很多免疫治 疗研究也着眼于活化的T细胞的相应作用。目前研究表明，颗粒酶是CTL细胞杀伤肿瘤细 胞的重要手段。颗粒酶是人体免疫细胞的分泌的细胞因子，在肿瘤免疫过程中发挥重要作 用。现已发现颗粒酶々、8、!1、6、11、1(等多个成员。其中颗粒酶B发挥重要作用。颗 粒酶B合成后，以酶原形式储存在细胞中，当杀伤性T细胞识别靶细胞时，颗粒酶B被 切除N端大小为20个氨基酸的酸性二肽，成为活性形式。活性型颗粒酶B进入细胞 后，可切割prOCaSpase-8(caspase-8原蛋白)，传导凋亡信号；通过水解Bcl-2家族成 员Bid，促进线粒体的细胞色素C释放，激活下游凋亡途径，导致细胞凋亡；可直接切割 procaspase-3 (caspase-3 Ι 胃白)，^L Caspase-3, M CAD (caspase activated DNAse)/ICAD(the inhibitor ofcaspase-activated DNAse)，产生有活性的 CAD，最终导 致 DNA 片断化(GOPNG I S, BARRYM, LISTON P, et al. Granzyme B-induced apoptosi s requires both direct caspaseactivation and relief of caspase inhibition. Immunity, 2003,18 (3) =355-365.) 0颗粒酶B也可直接激活ICAD及CAD，并启动不依赖于 caspase 的核凋亡(SHAR IF-ASKAR IE, ALAM A, RH EAUME Ε, et al. Direct cleavage of the human DNA fragmentation factor~45by granzyme B induces caspase-activated DNase release and DNA fragmentation. EMB0J,2001,20(12) :3101_3113.)。Caspase家族是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。刚合成的Caspases是无 活性的酶原形式，包括氨基端的prodomain结构和一个蛋白酶区域。Caspase的活化包括各 结构域间的蛋白酶解体，大小压机形成有活性的的异二聚体，最后两个异二聚体连接形成 四聚体。大小两个亚基对于酶的活性均是必需的。利用Caspase的抑制物已经将一些活化 Caspase分子的三维结构研究的比较清楚。如Caspase-8，Caspase-3等。这些研究显示， 活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小 亚基形成一球状分子，球状分子的核心为6个d螺旋环绕的6个β片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独 立发挥作用。Caspase活性中心有保守的五肽序列，即Gln-Ala-Cys-x-Gly。结构研究还显 示，在Caspase前体到活化Caspase的过程中，大亚基的羧基端和小亚基的氨基端顺势相邻 有利于形成正确的酶活性中心(Nicholson Dff, et al，Identification and inhibition of the ICE/CED3protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 376 37~43,1995. Thornberry ΝΑ, et al, A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukinl betaprocessing in monocyte. Nature 356 :768_774,1992)。Caspase-3 是 一个主要的凋亡效应因子。颗粒酶能切割Caspase-3原蛋白，产生一个具有部分酶活性的 中间体，该中间体与成熟酶在结构上很相似，然后，中间体进行自我切割，切去prodomain 结构，形成活化的Caspase-3，发挥促凋亡作用。凋亡是程序性细胞死亡的一种形态，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部 机制，导致细胞死亡的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学变化，早期表现为胞浆空泡，染 色质浓缩，随后胞浆空泡与细胞膜融合，与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩。细胞核也出 现核固缩、核碎裂、核溶解的过程。最后形成凋亡小体。凋亡细胞脱离组织，被巨噬细胞吞 噬，较少产生炎症反应。因此，诱导细胞凋亡为肿瘤治疗提供除化学治疗和放射治疗外的新 途径。但在此过程中需要新的方法，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的损害。目前肿瘤基因治疗的主要障碍是不能有效地将目的基因特异性转染所有的肿瘤 细胞，并使其在肿瘤细胞中表达。而基因治疗的疗效与肿瘤细胞受基因转染的数量密切相 关。因此，研究与发展促使目的基因在肿瘤细胞中表达在肿瘤治疗中至关重要。促使目的 基因在肿瘤细胞内特异性地表达并杀伤肿瘤细胞，不仅能提高治疗的效果，也能减少正常 细胞受到的伤害。启动子的研究和使用，为此提供了重要方法学基础。启动子是基因的一 个组成部分，控制目的基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，决定基因的活动。启动 子由核苷酸组成，其本身并不控制基因活动，而是通过与转录因子的结合而控制基因活动。 有研究表明，CEA启动子可启动双自杀基因CD和TK在CEA阳性的肿瘤细胞中表达(王天 宝，董文广，汪建平，CEA启动子特异性启动双自杀基因CD与TK在CEA+恶性肿瘤中表达中 华普通外科学文献(电子版)2008，2(1) :24-27)。人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子可 驱动野生型P53基因在人端粒酶阳性人大肠癌细胞株SW620中表达(黄明文，余新，洪葵 等，hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用中国临床医学，2008，15(3) 429-432)。存活素(Survivin)是凋亡蛋白抑制家族(inhibitorof apoptosis protein, IAP)成员，可抑制由Caspase介导的细胞凋亡。IAP家族在鸡、大鼠、人体内均能检 测到，现已发现 HIAPl， HIAP2， XIAP(X-chromosome link本文档来自技高网...
【技术保护点】
由启动子调控两种目的基因表达的重组载体，其特征在于构建方法如下所述： ①提取ｓｕｒｖｉｖｉｎ启动子基因， ②提取人的细胞基因ｍＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ， ③在ｃＤＮＡ中扩增第一目的基因， ④在ｃＤＮＡ中扩增第二目的基因， ⑤将内切酶切开的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ启动子基因片断与基本载体分子用连接酶连接成第一中间载体，将内切酶切开的第一目的基因片断与第一中间载体分子用连接酶连接成第二中间载体，将内切酶切开的第二目的基因片断与第二中间载体分子用连接酶连接成第三中间载体，将用内切酶切开的ＩＲＥＳ基因片断和第三中间载体用连接酶连接成重组载体， ⑥将重组载体引入受体细胞，转化或转染，培养转化细胞，使重组载体分子随受体细胞扩增，筛选出含有重组载体分子的受体细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，
申请(专利权)人：王玮，
类型：发明
国别省市：90
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