本发明专利技术提供了一种利用薄荷离体茎尖诱导同源多倍体的技术，可用于薄荷的多倍体育种。其关键技术在于通过秋水仙素处理浓度、时间和方法的控制，在短时间内获得大量薄荷同源多倍体植株，并采用流式细胞仪法进行倍性检测。采用本方法进行薄荷的多倍体诱导，诱导率较高(可达15％)，变异株成活率高(90％以上)，鉴定方法简单易行，可以大大缩短薄荷育种周期。??
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业
，涉及薄荷育种工作中的多倍体诱导和快速检测技术。
技术介绍
薄荷(Mentha h即localyx Briq.)的茎、叶中富含挥发油，被广泛地应用于食品、 医药、化妆品、香料、烟草等工业。薄荷全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、 喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等。薄荷是我国重要的香料和药用植物之一， 在江苏、安徽、江西等地广为栽培，已成为当地重要的农业特种经济作物。但是在薄荷生产 中出现的品种单一、品种退化现象，使薄荷的育种工作越来越引人注目。培育薄荷优良新 品种，对现行生产中的品种进行更新是一项亟待开展的工作。多倍体有很多二倍体所没有 的优势性状，如植株的巨大性、抗性增加、有机合成速率加快及克服远源杂交不育性，多倍 体育种用于薄荷的新品种选育具有良好的前景。多倍体育种在许多植物材料上已经成功运 用，但在薄荷上的应用尚未见报道。本专利技术来源于多年的研究结果，提供了一种薄荷同源多 倍体的诱导和检测技术，可用于薄荷的多倍体育种。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。采用本方法进行 薄荷的多倍体诱导，诱导率高(可达13%)，变异株成活率高(90%以上)，鉴定和扩繁同步 进行，可以大大縮短育种周期。主要内容包括如下 1.无菌体系的建立。用薄荷茎尖做为外植体，在初代培养基上建立无菌体系。初 代培养基为MS基本培养基+1. 0mg L-1 6-BA+0. 2mg L—、AA+5. 5g L-1琼脂+30g L-1蔗 糖，pH5. 5 5. 8，培养条件为温度25。C，光照时间8 10h/d，光照强度1500 20001x。 2.多倍体的诱导。取初代培养的无菌离体不定芽，用0. 1% 0.2%秋水仙素溶液 浸泡24 48h后，接种在不含秋水仙素的继代培养基上；或取初代培养的无菌薄荷离体不 定芽，接种在添加20mg L—1秋水仙素的继代培养基中，培养30d后转入不含秋水仙素的继 代培养基中继续培养。继代培养的培养基、培养条件与初代培养相同。 3.多倍体的鉴定。处理株继代培养20d后，取其叶片，用流式细胞仪检测染色体变 异状况。 4.多倍体植株的增殖培养。将染色体加倍植株的离茎尖最近的前两个带节茎段接种在含2. Omg L-1 6-BA+0. 2mg L-1 NAA的MS增殖培养基上，培养基中含5. 5g L-1琼脂、30g L-1蔗糖，pH 5. 5 5. 8，培养条件同上。培养20d，转接增殖2次。 5.多倍体植株的生根培养。将增殖苗接种在含0. 5mg L—1 6-BA+0. 2mg L—、AA的1/2MS生根培养基上，培养基中含5. 5g L—1的琼脂、30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8，培养条件同上。 6.炼苗和成苗。生根培养20d后，将生根苗培养瓶移出培养室，打开瓶盖，喷水保 湿，室温炼苗4 5d，取出加倍株，洗去培养基，栽入填有腐殖土、珍珠岩和沙(4 :3:2)3的穴盘内，放在室内遮阴保湿，3 5d后将穴盘移至田间遮阴棚内，常规方法管理。具体实施例方式实施例1 :以薄荷品种'68-7'为例。 切取薄荷品种'68-7'的大田苗茎尖，肥皂水清洗15min，流水冲洗30min，75X乙醇浸泡30s， 0. 1 % HgCl2浸泡7min，无菌水冲洗3次，接种于含1. Omg L—^-BA和0. 2mg L—、AA的MS初代培养基，培养基中含5. 5g L—1琼脂、30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8。培养条件为温度25。C，光照时间8 10h，光照强度1500 20001x。 取初代培养30d后的无菌苗不定芽，置于0. 2 %秋水仙素溶液中，保持25°C ± 1 ，在转速为90r 'min—1的摇床上浸泡24h后，用无菌水冲洗干净，接种在继代培养基上培养。继代培养的培养基与培养条件同初代培养相同。培养20d后，取叶片进行倍性鉴定。 倍性鉴定采用流式细胞仪测定法。取幼叶50mg，在提取缓冲液中研成粉末，500目尼龙网过滤，离心(1000r m—0 ，收集沉积细胞，加入染色液，暗处低温下染色30min。 500目尼龙网过滤，滤液用Coulter Epics XL型流式细胞仪(美国Beckman公司)检测，观察细胞染色体是否加倍。 检测结果显示染色体加倍的植株即为同源多倍体。取这些植株离茎尖最近的前两个带节茎段接种在含2. Omg L—1 6-BA和0. 2mg L—、AA的MS增殖培养基上，培养基中含5. 5g L-1琼脂、30g L-1蔗糖，pH 5. 5 5. 8。培养条件同上，培养20d，转接增殖2次。将增殖苗接种在含0. 5mg L—1 6-BA和0. 2mg L—、AA的1/2MS生根培养基上，培养基中含5. 5g L—1琼脂、30g L—1蔗糖，ra 5. 5 5. 8。培养条件同上。 20d后将生根苗培养瓶移出培养室，打开瓶盖，喷水保湿，室温炼苗4 5d，取出后洗去根部培养基，栽入填有腐殖土、珍珠岩和沙(4 : 3 : 2)的穴盘内，室内放置3 5d后，移至室外遮阴棚内，l个月后移入大田。 实施例2 :以薄荷品种'73-8'为例。 除以下区别外，其他步骤和方法与实施例1相同。 取初代培养30d后的无菌苗不定芽，接种在添加20mg *L—1秋水仙素的培养基(同初代培养基)中，培养30d后，转移到不含秋水仙素的继代培养基上培养20d，用于倍性检权利要求本专利技术，其特征在于包括以下步骤薄荷离体茎尖做为外植体在初代培养基上建立无菌体系，以一定浓度的秋水仙素处理离体无菌不定芽后，进行继代培养，以流式细胞仪法检测染色体倍性变化，检测确认的染色体加倍材料经增殖培养、生根培养、炼苗、移栽，即可获得多倍体植株。2. 根据权利要求1所述，初代培养建立无菌体系的方法，其特征在于以离体茎尖做为外植体；初代培养基为MS基本培养基+1. 0mg L—VBA+O. 2mg L—、AA+5. 5g L-1琼脂 +30g *L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8 ;培养条件为温度25。C，光照时间8 lOh，光照强度1500 20001x。3. 根据权利要求1所述，秋水仙素处理方法，其特征在于秋水仙素处理的材料为组织培养的离体不定芽；用O. 1% 0. 2X秋水仙素溶液浸泡24 48h后，接种在不含秋水仙素 的继代培养基上；或取初代培养的无菌薄荷离体不定芽，接种在添加20mg L—1秋水仙素的 继代培养基中，培养30d后转入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养。继代培养的培养 基、培养条件与初代培养相同。4. 根据权利要求l所述，多倍体的鉴定方法，其特征在于经秋水仙素处理的材料在继 代培养20d后，取叶片，用流式细胞仪进行倍性检测。染色体加倍的试管苗即为同源多倍 体。5. 根据权利要求1所述，倍性材料的增殖方法，其特征在于增殖培养基为MS基本培 养基+2. Omg L—VBA+O. 2mg L—、AA+5. 5g L—1琼脂+30g L—1蔗糖，pH 5. 5 5. 8 ;培养 条件为温度25t:，光照时间8 lOh，本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术薄荷同源多倍体的诱导和检测方法，其特征在于包括以下步骤：薄荷离体茎尖做为外植体在初代培养基上建立无菌体系，以一定浓度的秋水仙素处理离体无菌不定芽后，进行继代培养，以流式细胞仪法检测染色体倍性变化，检测确认的染色体加倍材料经增殖培养、生根培养、炼苗、移栽，即可获得多倍体植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李维林，于盱，梁呈元，刘艳，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：84
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