一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方法。本发明专利技术采用“组对组”的筛选策略，将噬菌体抗体库应用于整个被生物素标记的人血浆蛋白组，在液相实现二者的亲和吸附与分离，再对具有人血浆蛋白组分特异结合性的噬菌体抗体进行单克隆化与阳性鉴定，然后利用交联剂将阳性单克隆噬菌体交联成可用于亲和纯化的基质，用于人血浆蛋白组中对应目标抗原的纯化，最后用质谱技术实现目标抗原的鉴定，从而达到高效、迅速并且高通量地为任意人血浆蛋白组的组分筛选亲和配体的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组分的亲和配体的筛选和制 备方法。
技术介绍
血浆蛋白组是成分最复杂的人体蛋白组，包含了大多数的人源性蛋白质；它来源 广泛，适合大量收集；它无疑也是最具有代表性的蛋白组，由于每年有上亿份血样用于医学 诊断，其在临床上的重要性是无法替代的。自从HUPO的HPPP计划开展以来，上千种血浆蛋白在不同的策略下Q-DE-MS/MS 和2D-LC-MS/MS等)被鉴定出来。但是，大量的血浆蛋白在被鉴定后依然无法进行有效地纯化。一般说来，亲和层析是用于蛋白质纯化的最佳手段，仅仅通过一步纯化就能得到 纯度较高的目的蛋白。但是亲和层析技术的应用所遭遇的最大瓶颈就是亲和配体的开发， 难以找寻对目的蛋白亲和力高、特异性好的配体严重制约了亲和层析的广泛应用。以往制 备亲和配体的方法主要是单克隆抗体技术或者化学合成，不仅耗时久，而且成本高，然而噬 菌体展示技术的出现，为高效、快捷、经济地寻找亲和配体提供了途径。噬菌体展示技术是 将亲和配体展示在噬菌体的外壳蛋白上，然后通过一系列的筛选策略将目标受体特异性的 亲和配体从上百万甚至上亿个备选克隆中筛选出来，还可以通过优化筛选策略或者亲和力 成熟来获得具有合适亲和力的特异性配体。目前，基于噬菌体展示技术的配体筛选所针对 的目标都是单组份体系或特殊的多组分体系，如肿瘤细胞等，同时针对多组分体系的配体 筛选则鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了高通量地获得多组分体系中各单组分的可用于亲和纯化的 亲和配体。为了实现这一目的，我们建立这样一种方法，将筛选目标设定在蛋白组水平上， 通过一次或多次的筛选同时发现多个针对纯组分的特异亲和配体，并以最便捷的方式将配 体转化为可利用的亲和纯化基质。本专利技术所采用的工艺包括人血浆蛋白组的前处理和生物素标记；噬菌体抗体库的 筛选；单克隆噬菌体的制备；交联噬菌体抗体的制备；亲和配体目标抗原的鉴定。其中核心 技术为噬菌体抗体的交联技术。本专利技术的有益效果是实现了针对以人血浆蛋白组为代表的多组分体系的亲和配 体筛选，使得为亲和层析寻找配体的工作将会以一种高效、迅速并且高通量的方式进行。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是采用了一种“组对组”的筛选策略， 即从噬菌体抗体库中同时为整个蛋白质组中的任意组分寻找亲和配体。在使用完整的噬菌 体抗体库对整个人血浆蛋白组同时进行筛选之后，根据噬菌体抗体易于实现单克隆化的特点，先将针对人血浆蛋白组中若干组分具有特异结合性的噬菌体抗体单克隆化，然后用交 联剂将单克隆噬菌体交联，使之成为同时具有表型和基因型的亲和纯化基质，用其实现对 人血浆蛋白组中的对应目标抗原的纯化，再鉴定出被纯化出的目标抗原。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术建立的方法做进一步说明。图1是针对人血浆蛋白组进行亲和配体筛选的方法流程示意图。图2是利用单克隆交联噬菌体抗体得到的目标抗原的电泳图。图 3 是现有目标抗原 Amyloid protein 禾口 Apolipoprotein A-I precursor 的质 谱鉴定结果。具体实施例方式本专利技术所涉及的方法流程的示意图如图1所示，包括图IA 预处理的人血浆蛋白 组的生物素标记；图IB-E 噬菌体抗体库Tomlinson I+J在液相与被生物素标记的蛋白进 行多轮筛选；图IF 被筛选出的噬菌体次级抗体库实现单克隆化；图IG 利用ELISA方法鉴 定阳性噬菌体单克隆；图IH 利用戊二醛实现阳性噬菌体单克隆的交联；图II 使用交联 好的阳性单克隆噬菌体复合物作为亲和基质纯化血浆蛋白组中的目标抗原；图IJ 用质谱 鉴定纯化出的目标抗原。具体实施方式如下1.人血浆蛋白中高丰度蛋白HSA和IgG的分离为排除人血浆蛋白组中的高丰度蛋白对配体筛选的干扰，必须对蛋白组进行预处 理。人血浆中高丰度蛋白血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(IgG)分别通过Cikicronblue 3GA染料亲和柱和用protein A交联的kpharose 4B亲和柱进行分离。简言之，先用IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 6)平衡Cibacron blue 3GA亲和柱，将人血浆在4°C下离心10分钟，转速 6000Xg，去除少量血细胞后与等体积的平衡缓冲液混合，上样于Cibacron blue 3GA亲和 柱；在4°C混合过夜，然后收集穿过液。IgG的分离方法与HSA类似，将Cikicron blue 3GA 亲和柱的穿过液上柱于用IOmM Tris-HCl (pH7. 6)平衡过的proteinA亲和柱，在4°C混合过 夜，同样收集穿过液，即可得到含有低浓度HSA和IgG的血浆蛋白(HPP/HSA&IgG)。经检验 可用的HPP/HSA&IgG样品蛋白对PBS (pH7. 4)进行透析，保存待用。2.用于筛选的预处理血浆蛋白(HPP/HSA&IgG)的生物素标记在将HPP/HSA&IgG用于噬菌体抗体的液相筛选之前，必须对其进行生物素标记。 在每ImL样品蛋白中加入20 μ L浓度为IOmM的EZ- Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,于4°C下 放置2小时，标记即可完成，可以保证每个蛋白分子上至少有20个生物素标记(图1A)。将 标记好的蛋白溶液对PBS(pH7. 4)透析，可除去溶液中游离的生物素分子。3.噬菌体抗体库对生物素标记的HPP/HSA&IgG的液相筛选取Tomlinson I 库和 J 库各 0. 25mL(1013pfu/mL)与 0. 5mL 用生物素标记的 HPP/ HSA&IgG混合，在4°C振荡2小时，然后静置2小时(图1B)。接着加入200 μ L已混勻的 Immuno Pure Immobilized Streptavidin 亲和柱填料，在 4°C混合 2 小时(图 1C)。将混合 物用5000 Xg的转速离心1分钟，吸走上清并用灭菌PBS (含0. 1% Tween-20(v/v),pH7. 4)洗涤沉淀5次。用500μ LPBS(pH7. 4)稀释的胰蛋白酶(lmg/mL)浸泡沉淀10分钟，离心吸 出上清(图1D)。将大肠杆菌TGl过夜菌按1 50接种至20mL2XTY培养基中，37°C培养约2小 时，转速220rpm。待菌液的0D600光吸收值达到0. 4-0. 6时，取1. 75mL菌液与0. 25mL的胰 蛋白酶洗脱上清混合，37°C水浴30分钟。用涂板法测定菌液中噬菌体感染的滴度，并将浓 缩菌液全部涂于TYE培养基平板(0. 8% NaCl (w/v)，蛋白胨(w/v),0. 5%酵母粉(w/v)， 1.5%琼脂(w/v)，含葡萄糖(w/v)和10(^8/11^氨苄青霉素)，371培养过夜。次日用2mL的2XTY培养基将平板上的菌落全部冲洗下来，取50 μ L接种至 25mL2XTY培养基中(含葡萄糖(w/v)和100 μ g/mL的氨苄青霉素)，其余加入甘油至 终浓度为15% (v/v)，保存于-70°C。接种菌液在37°C培养(转速220rpm)至0D600光吸 收值达到0. 4-0. 6后，加入40 μ L的KMl3辅助噬菌体(1012pfu/mL)，在37°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方法，其特征在于以人血浆蛋白组为目标，使用噬菌体抗体库同时针对整个蛋白组进行筛选，一次性获得多个血浆蛋白组分的亲和配体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，张菁，钱晨，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84
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