本发明专利技术公开了一种SYBR?Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阴性参控品、阳性对照品、荧光聚合酶链式反应液、Taq酶和DNA提取液。本发明专利技术包括一个以荧光PCR技术为基础的PCR反应体系，包含针对沙眼衣原体特异序列的正、反向引物和荧光染料SYBR?Green，可以简便快速地在临床样本中检测沙眼衣原体感染，特异性高，对沙眼衣原体的早期检出有很大的临床价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸检测领域，在临床样本中检测沙眼衣原体感染的荧光 PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。
技术介绍
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)为革兰氏阴性病原体，没有合成高能 化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤 器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，比病毒大，比细菌小，呈球形， 直径只有0. 3 0. 5mm。CT是重要的性传播疾病的病原体之一，它不仅会导致阴道、尿道感 染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，导致盆腔炎、输卵 管损伤直至不孕。此外，此种病原体还与人乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的 感染有关。沙眼衣原体有独特发育周期，它的生长发育周期分两个阶段①原体(elementary body)，是发育周期的感染阶段，外有包壁，具感染力；②始体，又称网状体(initial body), 是在感染细胞内的繁殖阶段，无包壁，无感染性，具增殖力。原体(约0.3 μ m)与易感细胞 接触后通过吞饮作用进入细胞，形成空泡称为包涵体，包涵体外膜来自于感染细胞时的浆 细胞膜。此时结构致密的原体逐渐发育成结构疏松的始体(约1 μ m)，开始了 RNA与DNA的 合成并以二分裂方式开始增殖，经过M 7 增殖始体重新形成原体，包涵体溶解，细胞释 放出原体。沙眼衣原体引发的病变主要有沙眼由衣原体沙眼生物变种A、B、Ba、C血清型引起。主要经直接或间接接触传 播，即眼-眼或眼-手-眼的途经传播。当沙眼衣原体感染眼结膜上皮细胞后，在其中增殖 并在胞浆内形成散在型、帽型、桑椹型或填塞型包涵体。该病发病缓慢，早期出现眼睑结膜 急性或亚急性炎症，表现流泪、有粘液脓性分泌物、结膜充血等症状与体征。后期移行为慢 性，出现结膜瘢痕、眼睑内翻、倒睫、角膜血管翳引起的角膜损害，以致影响视力，最后导致 失明。据统计沙眼居致盲病因的首位。1956年中国学者汤飞凡等人用鸡胚卵黄囊接种法， 在世界上首次成功地分离出沙眼衣原体，从而促进了有关原体的研究。包涵体包膜炎由沙眼生物变种D-K血清型引起。包括婴儿及成人两种。前者系 婴儿经产道感染，引起急性化脓性结膜炎(包涵体脓漏眼)，不侵犯角膜，能自愈。成人感染 可因两性接触，经手至眼的的途径或者来自污染的游泳池水，引起滤泡性结膜炎又称游泳 池结膜炎。病变类似沙眼，但不出现角膜血管翳，亦无结膜瘢痕形成，一般经数周或数月痊 愈，无后遗症。泌尿生殖道感染经性接触传播，由沙眼生物变种D-K血清型引起。男性多表现为 尿道炎，不经治疗可缓解，但多数转变成慢性，周期性加重，并可合并副睾炎、直肠炎等。女 性能引起尿道炎、宫颈炎等，输卵管炎是较严重并发症。该血清型有时也能引起沙眼衣原体 性肺炎。性病淋巴肉芽肿由沙眼衣原体LGV生物变种引起。LGV要通过两性接触传播，是 一种性病。男性侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。女性可侵犯 会阴、肛门、直肠，出现会阴，肛门，直肠组织狭窄。目前沙眼衣原体的培养检查法是经典的检查方法，但由于需要特殊的设备及试剂 且实验方法复杂，技术要求高，费时且费用较高而并不适合临床应用。目前检测衣原体技术 发展很快，方法日渐增多。检测抗原的有改良荧光检测法，金标男女两用衣原体快速检测试 剂盒，分子生物学技术应用于检测衣原体的方法更是日新月异，(1)连接酶链反应(LCR)， (2)转录介导的扩增试验(TMA), (3)酶放大免疫反应(PCE)，(4)聚合酶链反应(PCR)，(5) 半巢式聚合酶链反应-微空板杂交法，(6)巢式聚合酶链反应，(7)实时荧光聚合酶链反应 定量检测。荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针，SYBR Green法等，本方法涉及的是STOR技术。其工作原理是Green是一种结合于小沟中 的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物 的检测非常理想。STOR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在 PCR反应体系中，加入过量STOR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧 光信号，而不掺入链中的STOR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加 与PCR产物的增加完全同步。
技术实现思路
为克服传统方法对CT检测的缺点，本专利技术提供一种特异性高、成本低的检测产 品。本专利技术技术方案如下一种STOR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳 性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR 分型引物。所述的阳性对照品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插 入的特异序列如下GACAGGGACT AAGGATGCCT CTATTGACTA CCATGAGTGG CAAGCAAGTT TAGCCCTTTC TTACAGATTAAATATGTTCA CTCCTTACAT TGGAGTTAAA TGGTCTAGAG TAAGTTTTGA TGCCGACAOG ATC0GTATCGCTCAGCCTAA ATTGGCTGAA GCAATCTTGG ATGTCACTAC TCTAAACCCG ACCATCGCTG GTAAAGGAACTGTGGTCGCT TCCGGAAGCG AAAACGACCT GGCTGATAC249bp所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果循环值小于30. 0。所述的阴性参考品为沙眼衣原体阴性血清。所述的PCR分型引物序列如下扩增检测沙眼衣原体的正向引物GACAGGGACTMGGATGCCTCTAT 24;扩增检测沙眼衣原体的反向引物GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG21。所述的荧光PCR反应液加入了 SBRY Green的荧光染料。如此可以通过荧光信号 的收集判断有无沙眼衣原体的存在。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果①具有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直 观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶 电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险；②STOR Green与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设 计的程序通用性好，且价格相对较低；③利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增 产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定；④检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时，操作步骤简单；⑤可同时进行高通量的样本检测。 总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在 两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法检测沙眼衣原体感染的荧光ＰＣＲ试剂盒，其特征在于，包括阴性参考品、阳性对照品、Ｔａｑ聚合酶、荧光ＰＣＲ反应液，以及ＤＮＡ提取液；所述的荧光ＰＣＲ反应液包括ＰＣＲ分型引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：穆海东，汪宁梅，穆宇豪，黎飒，
申请(专利权)人：上海裕隆临床检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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