本发明专利技术涉及一种在肿瘤细胞表面合成α-半乳糖苷表位(α-Gal)并激活免疫细胞的方法，利用陈旧的、经福尔马林固定的或经石蜡包埋的肿瘤标本，经α-1，3-半乳糖苷转移酶催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷(α-Gal)表位，增强肿瘤抗原性，并以此作为疫苗。这些肿瘤细胞膜上的α-Gal表位体外可被抗原呈递细胞(APC)吞噬，激活T/CIK细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T/CIK细胞，这些免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷表位(α -Gal)并激活免疫细胞的方法，具体而言，本专利技术利用陈旧的、经福尔马林固定的或经石蜡包埋的肿瘤标本，经 α-1，3_半乳糖苷转移酶(GT)催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷(α-Gal)表位，增强肿瘤抗原性，并以此作为疫苗。这些肿瘤细胞膜上的α-Gal表位体外可被APC细胞吞噬，激活T细胞和CIK细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T细胞和CIK细胞，这些扩增的免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。
技术介绍
特异性免疫治疗肿瘤的基本原理是诱导针对肿瘤相关抗原(tumour associated antigen, TAA)的有效免疫反应，从而杀伤残留的肿瘤细胞。然而，用自体的肿瘤细胞作为瘤苗来免疫肿瘤患者并不很成功，主要由于TAA的免疫原性较弱，以及作为疫苗的肿瘤细胞膜不能充分地被APC(DC细胞是一种功能强大的APC细胞)摄取。增强TAA的免疫原性的一个可能办法就是将肿瘤细胞膜上的抗原扩增，同时与相应的抗体结合，形成免疫复合物， 通过免疫复合物中IgG分子的Fc片段与APC细胞膜上的Fc受体相结合，促进APC对肿瘤细胞膜的吞噬。这个过程可以通过体外肿瘤细胞膜上合成α-1，3-半乳糖苷(a-Gal)表位以达到扩增肿瘤相关抗原，同时利用人类血清中存在的天然的抗α -Gal表位的抗体与带有α -Gal表位的肿瘤相关抗原形成免疫复合物来实现。用α -1,3-GT在肿瘤细胞膜表面扩增肿瘤抗原的研究早在90年代末期就开始， 自从 LaTemple 等人 艮道(LaTemple DC, Henion TR, Anaraki F，Galili U. Synthesis of alpha 1，3-galactosyl epitopes by recombinant alpha-1,3-galactosyltransferase for opsonization of human tumor cell vaccines by anti-galactose.Cancer Res 1996,56 :3069-3074)将a-l，3-Gal表位接到肿瘤细胞膜表面以扩增其肿瘤相关抗原的免疫原性以来，相继有众多的研究者用不同的方法在新鲜肿瘤细胞膜表面添加α -1,3-Gal 表位，并以此作为肿瘤疫苗(Galili U, LaTemple DC. Natural anti-Gal antibody as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity. Immuno Today 1997,18 :283-285 ；Galili U, Chen ZC, Manches 0， Plumas J, Preisler H. Preparation of autologous leukemia and lymphoma vaccines expressing alpha-gal epitopes. Hematother Stem Cell Res. 2001,10(4) :501-511)，国内也有类似报道(邢力，郭札和，利用人的天然抗体抗肿瘤，中国肿瘤生物治疗杂志2001,8(1) :67-69)。因为这些方法都可以增加肿瘤的抗原性，动物实验比较成功，I、II期临床试用也已开始(Galili U. Autologous tumor vaccines processed to express alpha-gal epitopes :a practical approach to immunotherapy in cancer. Cancer Immunol Immunother. 2004,53(11) :935-945 ； Manches 0， Plumas J， Lui G， Chaperot L， Molens JP, Sotto JJ, Bensa JC, Galili U. Anti-Gal-mediated targeting of human B lymphoma cells to antigen-presentingcells :a potential method for immunotherapy using autologous tumor cells. Haematologica. 2005,90(5) :625-634 ；Posekany KJiWiley JEiGagnon GA. A novel method to display alpha—1，3_gal antigens on human leukemic cells for preparation of anti-leukemia vaccines. Anticancer Res. 2009，29 (6) :2387-2392 ；Galili U，Chen ZC, DeGeest K. Expression of alpha-gal epitopes on ovarian carcinoma membranes to be used as a novel autologous tumor vaccine. Gynecol Oncol. 2003,90 (1) :100-108)。虽然这些技术可以使人类肿瘤细胞膜表面合成α半乳糖苷表位，肿瘤抗原性得以扩增，也可以促进APC细胞对肿瘤细胞抗原的吞噬，但他们无一例外地应用活的肿瘤组织和细胞。如1999年LaTemple等人报道方法，他们都利用活的、新鲜的肿瘤标本。国内邢力等人也是用活的肿瘤细胞，用转基因的方法在肿瘤细胞膜表面表达α "Gal表位，此方法除了必须应用活的标本外，还存在细胞的基因转染率较低，成本高，所需时间长等缺点。但是我们知道，很多临床情况下，手术医生为了方便，手术切除的肿瘤组织都直接放到福尔马林内固定，没有留有新鲜的、活的肿瘤标本。因此，多数情况下，肿瘤标本已用福尔马林固定，石蜡包埋，没有新鲜的、活的肿瘤组织可用。为了使人肿瘤细胞膜表面合成 α -半乳糖苷表位，上述文献记载的免疫治疗技术都需要应用活的肿瘤标本，而对那些没有在当时保留活的肿瘤标本的患者，这种免疫治疗技术则无法进行。本专利技术克服了上述不利因素，本专利技术是利用陈旧的、经福尔马林固定的、或经石蜡包埋的肿瘤标本，经α -1，3-半乳糖苷转移酶催化，在肿瘤细胞膜上合成半乳糖苷表位，增强肿瘤抗原性，以此作为疫苗。体外被APC细胞吞噬，激活T细胞，同时体外快速扩增肿瘤特异性T细胞。这些免疫活性细胞可以特异性地杀伤体内肿瘤细胞。本专利技术不受标本福尔马林固定的影响，甚至石蜡包埋的标本也可以应用。本专利技术既可以用新鲜肿瘤组织、细胞，又可以用已经被福尔马林固定，甚至已被石蜡包埋的肿瘤标本。所以只要有肿瘤标本，这种肿瘤个体特异性免疫治疗技术就可以实施。 期望能够用于肿瘤患者，彻底消灭体内残留的肿瘤细胞，以达到根治肿瘤的目的。本专利技术利用a-l，3_GT在福尔马林固定的肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，以及在石蜡包埋的肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，在国内外均属首次。
技术实现思路
一种在肿瘤细胞表面合成α -半乳糖苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种在肿瘤细胞表面合成α－半乳糖苷表位的方法，其特征在于其具体步骤为：从已用福尔马林固定或已用石蜡包埋的肿瘤组织中分离肿瘤细胞，用１ｍｌ组成为０．１Ｍ ＭＥＳ（ＰＨ ６．２），２５ｍＭ ＭｎＣｌ２和１ｍＭ ＵＤＰ－ｇａｌ的酶缓冲液将上述分离的肿瘤细胞重新悬浮，然后加入１ｍＵ神经氨酸酶，５Ｕ重组半乳糖苷转移酶（α－１，３－ＧＴ），在３７℃、３０分钟温浴，随后，分别用含有１ｍＭ ＥＤＴＡ的生理盐水和不含ＥＤＴＡ的生理盐水清洗２次，即得到细胞膜上已合成α－半乳糖苷表位的肿瘤细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：云升，邱英，
申请(专利权)人：内蒙古医学院，
类型：发明
国别省市：15
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