一种用伞滑刃属线虫侵染拟南芥的方法技术

本发明专利技术公开了一种用伞滑刃属线虫侵染拟南芥的方法。本发明专利技术提供的方法包括如下步骤：将伞滑刃属的线虫接种于叶柄有伤口的拟南芥；所述拟南芥为出苗10天以后的拟南芥。本发明专利技术通过筛选接种条件获得了较高的侵染率，证明拟南芥可以作为伞滑刃属线虫的替代寄主，克服了松树作为寄主研究松材线虫致病分子机制时存在的遗传背景复杂，基因操作困难的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
伞滑刃属线虫(Bursaphelenchus spp.)包括丰公材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟丰公材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)等。松材线虫是我国二类检疫性线虫，也是国际上公认的重要的检疫性有害生物，它所引起的松材线虫病是松树的一种毁灭性病害，可危害50多种松属树种和10多种非松属树种，松树感病后一般2 3月内死亡。自1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病以后， 该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，目前我国已有15个省(区、市)的197个县 (市、区)发生松材线虫疫情，致死松树5亿多株，毁灭松林500多万亩，经济损失数千亿元， 松材线虫病已成为绿色松林资源的一大“杀手”。松材线虫病涉及到寄主、线虫、天牛、真菌、细菌以及环境因素等多个方面，致病机理尚未研究清楚，且发病速度快、传播途径广、寄主种类多，防治难度大，目前还没有十分经济、有效的防治方法。抗病育种，是防治植物病害的主要方法之一，其效果稳定，成本低，能减轻或避免农药对环境的污染，有利于保持生态平衡等。松树抗病育种也是防治松材线虫一种行之有效的方法。研究松材线虫的致病机理，了解松材线虫-寄主互作的分子机制，获得在松材线虫寄生和致病过程中起关键作用的靶标基因，为研制出针对松材线虫靶标蛋白的特异性药物以及抗线育种提供理论依据。目前松材线虫致病机理的研究仅停留在对致病相关基因的分离鉴定方面，由于RNAi干扰在松材线虫上效果不稳定，导致致病基因功能的研究分析陷入困境。同时，松树复杂的遗传背景，薄弱的分子生物学研究基础及遗传操作的困难也阻碍了松材线虫致病机理及与寄主互作的分子机制研究。Kirst等000；3)对火炬松木材形成有关组织器官进行了大规模高质量的EST测序和分析，发现大于IlOObp的基因序列中90%以上可在拟南芥中找到相似的表达序列； Avila和Liu分别将松属谷氨酰胺合成酶基因和病原/伤口诱导的raiO基因的启动子转入拟南芥中，发现松属植物不仅基因组与拟南芥有极高的相似性，而且基因表达调控模式也很相似。松材线虫属于迁移性内寄生线虫，在寄主体内自由移动取食，各龄期均可侵染松树且取食过程中并无虫体变形现象发生，该线虫主要寄生在树干树枝内。建立松材线虫侵染拟南芥的方法，以拟南芥作为替代寄主研究松材线虫与植物的相互关系，这将为松材线虫与寄主互作的分子生物学机制研究提供极大的便利，为揭示该线虫的致病机理提供研究平台。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的用伞滑刃属线虫侵染拟南芥的方法，包括如下步骤将伞滑刃属线虫(Bursaphelenchus spp.)接种于叶柄有伤口的拟南芥；所述拟南芥为出苗10天以后的拟南芥。所述伞滑刃属线虫为松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)或拟松材线虫 (Bursaphelenchus mucronatus)。每株所述拟南芥可接种300-400条所述线虫。所述拟南芥可为出苗10至25天的拟南芥。所述拟南芥可为Chi-O生态型拟南芥、C24生态型拟南芥、Col-O生态型拟南芥、 Nd-I生态型拟南芥、Pa-3生态型拟南芥、Ler生态型拟南芥、Est-I生态型拟南芥、Ws_2生态型拟南芥、Sha生态型拟南芥或Kas-I生态型拟南芥。所述线虫优选为无菌线虫。所述无菌线虫的制备方法可包括如下步骤(1)将所述线虫进行消毒；(2)收集步骤(1)得到的线虫的虫卵；(3)将步骤(2)收集的虫卵进行消毒；(4)将步骤(3)得到的虫卵培育为线虫，即为无菌线虫。所述步骤⑴具体包括如下步骤将所述线虫用无菌M9溶液洗涤，然后用 lg/100mL硫柳汞水溶液消毒30min (室温)，然后用溶液甲4°C消毒IOh ；所述M9溶液由溶质和水组成；所述溶质及其在所述M9溶液中的浓度如下22mM KH2PO4,42mM Na2HPO4, 85. 5mM NaCiamM MgSO4 ；所述溶液甲由硫酸链霉素、放线菌酮和水组成，硫酸链霉素的浓度为0. lg/100mL，放线菌酮的浓度为0. 02g/100mL。所述步骤( 具体包括如下步骤将步骤(1)得到的线虫接种到长有灰葡萄孢菌菌落的培养基(如PDA培养基)上培养，观察到虫卵产出后用无菌水冲洗并收集线虫并用 lg/100mL硫柳汞水溶液消毒30min (室温)；然后将线虫置于装有0. 9%无菌生理盐水(即 0. 9g/100mL的氯化钠溶液)的培养皿中25°C培养，直至观察到大量虫卵产出，倒掉溶液，用无菌水冲洗后用溶液乙收集培养皿上附着的虫卵；所述溶液乙由吐温、NaOH和水组成，吐温的体积百分含量为0. 05%, NaOH的浓度为8mM。所述步骤C3)具体包括如下步骤将步骤( 收集的虫卵用所述无菌M9溶液洗涤，然后用lg/100mL硫柳汞水溶液消毒30min (室温)，然后用所述溶液甲4°C消毒10h。所述步骤(4)具体包括如下步骤将步骤( 得到的虫卵接种到长有灰葡萄孢菌菌落的培养基(如PDA培养基)上进行培养，直至虫卵发育为线虫。所述步骤中还可包括将所述虫卵和所述线虫进行PCR鉴定的步骤；所述PCR鉴定所用的引物为序列表的序列I(Fl)和序列表的序列2 (F2)组成的引物对。以上任-所述方法均可应用于如下(a)或(b)或(C)或(d)(a)鉴定伞滑刃属线虫的致病力；(b)鉴定不同生态型的拟南芥对伞滑刃属线虫的敏感性；(c)植物中具有抗伞滑刃属线虫功能的基因的分离和鉴定；(d)培育抗伞滑刃属线虫植物。所述伞滑刃属线虫可为松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)或拟松材线虫 (Bursaphelenchus mucronatus)。所述拟南芥可为Chi-O生态型拟南芥、C24生态型拟南芥、Col-O生态型拟南芥、Nd-I生态型拟南芥、Pa-3生态型拟南芥、Ler生态型拟南芥、Est-I生态型拟南芥、Ws_2生态型拟南芥、Sha生态型拟南芥或Kas-I生态型拟南芥。在拟南芥出苗15天后叶柄有伤口的情况下接种400条/株线虫，拟南芥被侵染率可高达90%，因此，拟南芥可以作为松材线虫的替代寄主对松材线虫进行后续研究。实施例 5的实验结果表明，本专利技术可以快速高效的筛选不同生态型拟南芥对松材线虫的敏感性，虽然目前测试的9个生态型中并没有完全抗松材线虫侵染的生态型，但对松材线虫的敏感程度不同。实施例6的实验结果表明，本专利技术也适用于拟松材线虫，具有弱致病力的拟松材线虫对拟南芥的侵染率没有松材线虫的高，说明拟南芥可以用来鉴定不同致病力的松材线虫和拟松材线虫。本专利技术在获得无菌松材线虫的基础上，通过筛选线虫的接种方法、接种浓度、接种时期，建立了在无菌条件下伞滑刃属线虫(特别是松材线虫)侵染拟南芥的最佳方法，使拟南芥作为伞滑刃属线虫的替代寄主成为现实。本专利技术可用来筛选抗伞滑刃属线虫的拟南芥生态型，进而分离获得抗性基因，为抗线育种提供条件，也可以用来鉴定不同来源伞滑刃属线虫的致病力。利用本专利技术方法筛选出的抗伞滑刃属线虫的拟南芥生态型，可以加速对伞滑刃属线虫(特别是松材线虫)致病机理及伞滑刃属线虫与植物互作分子机制的研究，为防治松材线虫提供理论指导。同时拟南芥基因组测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用伞滑刃属线虫侵染拟南芥的方法，包括如下步骤：将伞滑刃属的线虫接种于叶柄有伤口的拟南芥；所述拟南芥为出苗１０天以后的拟南芥。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：简恒，赵海娟，郭全新，刘倩，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11