一种获得诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种获得诱导性多能干细胞的方法，利用p53siRNA、VPA和Vc联合Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc之间的协同作用，有效抑制p53蛋白表达，降低细胞凋亡，促进多能基因Oct4表达，改变细胞周期，获得高效诱导性多能干细胞。本发明专利技术方法获得的诱导性多能干细胞可促进了多能干细胞在药物筛选、疾病机理研究、生物组织工程、细胞移植等生物学领域的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种高效获得诱导性多能干细胞的方法。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，能分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、 神经细胞、胰岛素细胞、心肌细胞等，在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域极具应用价值。人ESCs的研究一直面临着许多难题和争议。支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行ESCs 研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时的生命形式。破坏胚胎已经触及了人类伦理观念甚至宗教和法律等问题，这是人ESCs研究面临的最大障碍。同时，作为为临床组织器官或细胞移植提供大量材料的“种子细胞”，ESCs定向诱导分化的终末器官或细胞不能存在同种异型个体间的移植排斥，这就要求剔除ESCs中的免疫排斥基因，而这一难题一直困扰着免疫学界及医学界。伦理法律以及免疫排斥等壁垒，制约了 ESCs技术的进一步发展和应用。人们努力尝试不同途径实现体细胞重编程以获取ESCs或ESCs样的细胞。细胞核移植是其中的一种主要技术，即将患者体细胞与ESCs的细胞融合，但这种方法获得的ESCs 是四倍体，不适用于临床，而且克隆效率低，产生的许多后代在各个阶段出现严重的发育异常。同时，卵母细胞来源使得核移植实验受到强烈伦理学质疑。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的问世，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时自体细胞重编程也克服了异体移植存在的免疫排异问题。2006，日本科学家通过导入4种转录因子0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即iPSCs，随后，人的iPSCs也用同样的基因改造方法获得。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有里程碑意义。iPSCs具有与 ESCs类似的生物学特征，如细胞体积较小，细胞核大，胞质胞浆少。体外培养时，细胞排列紧密，呈克隆状生长，克隆和周围存在明显界限，而形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。表达时相专一性胚胎抗原(Stage specific embryonic antigen, SSEA)，可以检查到0ct4基因的表达，SSEA和0ct4蛋白是发育全能性的标志。iPSCs还表达 ESCs其它特征性表面抗原如 ^ι-1-60、 ^ι-1-81，细胞特征性内源蛋白Nanog、Sox2、Lir^8 等，iPSCs中碱性磷酸酶AP及端粒酶活性也较高。将iPSCs注入免疫缺陷小鼠体内，能形成含有3个胚层的畸胎瘤。iPSCs体外可以分化成多种细胞谱系，如神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年7月，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs克隆出活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs —样具有全能性。全基因组微阵列分析表明，iPSCs基因总表达谱接近于ESCs，而不是原来的靶向细胞。患者来源的体细胞重编程获得的iPSCs，是“个体特异的”或“疾病特异的” iPSCs， 不仅可以在体外大量扩增，还可以根据患者的需要，定向分化成与患者遗传上相匹配的特定组织的健康细胞，用来取代病变细胞。体细胞重编程技术为解决干细胞移植中存在的细胞来源不足，MHC不合，移植物抗宿主病(GVHD)和宿主抗移植物反应(HVGR)免疫排斥等问题提供了新思路和新技术。疾病特异性的iPSCs也是研究疾病发生机理和筛选阻止组织退行药物的重要工具。因此，iPSCs的问世成功不仅规避了干细胞研究一直以来面临的伦理和法律等障碍，而且消除了潜在的移植免疫排异反应，iPSCs替代ESCs在医学领域、组织工程、药物发现与评价等方面显示出广阔的应用前景。但人们对iPSCs技术的研究尚在初级阶段，其效率低是iPSCs应用面临的主要障碍之一。在各种诱导方法中，逆转录病毒载体诱导细胞重编程效率最高，也仅为0.01% 左右，慢病毒、腺病毒更低。为获得高效的iPSCs转化技术，其核心是如何通过异源表达 0ct4、Sox2等基因快速启动细胞内源性0ct4、Nanog等多能相关性基因的表达。研究表明，利用小分子化合物影响染色质的表观遗传修饰，激活或抑制部分信号通路(如Wnt、 P53-p21、MAPK、GSK3等通路)，调控基因的沉默与表达有助于提高成体细胞逆分化为iPSCs 的效率。另外，许多具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和存活，有利克隆形成的功能性的非肽类/肽类的小分子物质也能够提高iPSCs诱导效率。有研究相继报道，组氨酸去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂丙戊酸(valproic acid, VPA), p53 干扰 RNA (short-interfering RNA, siRNA)，维生素 C (vitamin C, Vc)有效促进 iPSCs 生成效率。VPA通过抑制组蛋白去乙酰化酶来改变染色体的表观遗传修饰，提高细胞的重编程效率。通过对p53基因调控的蛋白功能进行分析，发现p53-p21信号通路抑制iPSCs的生成， 而p53siRNA通过抑制p53-p21信号通路降低细胞的凋亡，可以将皮肤细胞重编程效率提高百倍。Vc通过促进相关胚胎干细胞基因表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，有利鼠和人体细胞的完全重编程。细胞重编程过程是一个动态和复杂的过程，该过程中涉及的信号通路的关闭或开启机理还不清楚。当细胞从分化的状态重塑回到类ESCs的过程中，细胞获得了趋向永生化和多向分化潜能的特征，因此通过影响染色质表观遗传修饰、激活ESCs相关信号通路、抑制细胞凋亡以及改变细胞周期等不同方面都可能有利于提高细胞重编程的效率，我们猜测联合p53siRNA，VPA和Vc，从改变染色体表观遗传修饰、细胞永生化、细胞存活率以及细胞基因表达谱的变化等不同方面协同作用，对细胞重编程效率的影响可能高于单个物质的作用。如何获得高效的iPSCs技术成为目前国际上干细胞研究领域的热点。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)是骨髓造血微环境的重要组成部分，对血细胞的再生和调控有着重要意义。虽因具有强大的可塑性、弱免疫原性及与血液系统关系的紧密而被广泛用于血液系统疾病、部分免疫缺陷性疾病治疗，但仍然解决不了干细胞移植中存在的问题。另外，体内hBM-MSCs 数量有限，体外培养时，分裂次数有限，这些不足也限制了 hBM-MSCs的临床应用。以hBM-MSCs为目的细胞，建立高效获得iPSCs的方法，不仅积极推进iPSCs和 hBM-MSCs的临床应用和研究，而且为获得病人特异的细胞提供了源源不断的种子细胞来源，并为研究疾病机理、筛选药物等提供理想的细胞模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，通过以下技术方案实现1.细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞(mous本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种获得诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：（１）细胞制备选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素Ｃ处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取骨髓，通过密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得人骨髓间充质干细胞，选择生长状态良好的人骨髓间充质干细胞，用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；（２）获得诱导性多能干细胞利用含有四种转录因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４和ｃ－Ｍｙｃ的病毒和ｐ５３干涉ＲＮＡ病毒转染，并在培养系统中加入组蛋白去乙酰基酶抑制剂丙戊酸钠和维生素Ｃ的人骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞为实验组，含有四种转录因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４和ｃ－Ｍｙｃ的病毒单独处理或病毒分别联合ｐ５３干涉ＲＮＡ、丙戊酸钠、维生素Ｃ或丙戊酸钠＋维生素Ｃ的人骨髓间充质干细胞作为对照组，以确定ｐ５３干涉ＲＮＡ、丙戊酸钠、维生素Ｃ的不同组合联合病毒转染人骨髓间充质干细胞获得诱导性多能干细胞的效率；病毒包装按照常规方法进行，利用脂质体２０００转染试剂盒进行２９３Ｔ细胞转染，孵育２４－７２小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的人骨髓间充质干细胞，将含有四种转录因子的病毒按照１∶５比例加入培养系统中，进行病毒转染，实验组和相应的对照组同时进行ｐ５３干涉ＲＮＡ病毒转染，病毒转染２４小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，实验组中的培养基加入丙戊酸钠和维生素Ｃ，对照组中的培养基或加入丙戊酸钠或加入维生素Ｃ或丙戊酸钠＋维生素Ｃ或什么都不加，丙戊酸钠连续加７天，维生素Ｃ加到克隆形成，对克隆进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，徐玉林，刘丽珍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86