本发明专利技术涉及一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，包括HCVNS5B基因扩增引物、HCVNCR保守区域基因扩增引物、HCVRNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、PCR反应液和PCR测序试剂，其中，HCVNS5B基因上游引物序列为SEQIDNo.1所示，HCVNS5B基因下游引物序列为SEQIDNo.2所示，HCVNCR保守区域基因上游引物序列为SEQIDNo.3所示，HCVNCR保守区域基因上游引物序列为SEQIDNo.4所示。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度很高，特异性好，可以检测已报道的所有HCV基因型(亚型)，速度快，可在12~14小时完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，用于快速检测患者血液样品中丙型肝炎病毒的型及亚型，属于医疗器械领域。
技术介绍
丙型肝炎病毒(h印atitis C viry s, HCV)是一种单股线性正链RNA病毒，是重要的肝病致病因子之一，严重威胁人类健康。目前全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV感染患者发展为肝癌，继而引起消化道出血和腹水。肝病患者中由HCV 感染导致的死亡正逐步增多。丙型肝炎病毒包括9400左右个氨基酸，HCV基因组具有一个单独的开放阅读框， 编码一具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV基因组中各种基因结构和功能不同，有些区域高度保守，如5’非编码区，非结构区。HCV具有高度的变异性，本身又具有负选择作用，导致了 HCV基因分型众多，目前已知HCV至少可分为6型(HCV1-6型)，各型又分为许多亚型(如la，lb, 2a, 2b, 3c等)，共70多种亚型。各型核酸序列之间相差31-34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差20-23%。不同型别的HCV对治疗药物如干扰素、利巴韦林的敏感程度不同，区别患者的HCV基因型对临床治疗用药非常有帮助。目前对HCV基因分型的方法主要有=ELISA法，荧光定量PCR法，限制性片段长度多态性，型特异性探针核酸杂交分析法等。这些方法敏感性、特异性低，只能区分出主要的几种基因型，对亚型分型能力不足，不能满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种能快速、敏感地检测HCV基因型的试剂品.ο由于同一基因型、不同亚型HCV5’非编码区序列的差异度仅为1%-3. 3%，而NS5B基因序列的差异度为16. 5%-20. 1%，NS5B基因更适合用于HCV的基因分型。因此，根据HCV NS5B区基因序列而进行的基因分型被公认为HCV基因分型的“金标准”。本专利技术为了提供对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，首先设计了 HCV NS5B基因引物。HCV NS5B基因上游引物序列为5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3‘ (SEQ ID No. 1) HCV NS5B基因下游引物序列为 5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ (SEQ ID No. 2) 同时设计了 HCV NCR保守区域基因引物3HCV NCR保守区域基因上游引物序列为5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3，(SEQ ID No. 3) HCV NCR保守区域基因下游引物序列为 5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3，(SEQ ID No. 4)本专利技术提供的对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，包括HCV NS5B基因扩增引物、 HCV NCR保守区域基因扩增引物、HCV RNA提取试剂、阴性对照和阳性对照、cDNA合成试剂、 PCR反应液和PCR测序试剂，其中，HCV NS5B 基因上游引物序列为5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3， HCV NS5B 基因下游引物序列为5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ HCV NCR保守区域基因上游引物序列为5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3， HCV NCR保守区域基因下游引物序列为5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3， 其中HCV RNA提取采用酚氯仿提取法提取，提取试剂为TRIzol，氯仿、异丙醇、无水乙醇和无RNase去离子水。其中的阴性对照和阳性对照，以去离子水为阴性对照，以已知型别的含有HCV样品为阳性对照。其中的cDNA合成反应液包括200 U/μ L逆转录酶(M-MLV)、40 U/μ L RNase 抑制剂、50 μ M Oligo (dT)15、50 μ M随机引物(Random primer)、5 X第一链合成缓冲液 (first-strand buffer) > 无 RNase 的去离子水(RNase-free ddH20)、10 mM dNTPs。其中的PCR反应液包括10XPCR混合液(premix)、0. 25 pmol/ μ L的引物、 2. 5 4. 0 mM 的氯化镁、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs。其中PCR测序试剂为4 μ L测序缓冲液，1 μ L DNA模板，1 μ L测序引物。用本专利技术的试剂盒检测临床待检者外周血HCV基因型，检测方法如下首先制备待检者血液样品中的丙型肝炎病毒RNA，使用RNA提取试剂盒得到丙型肝炎病毒RNA，以此提取到的RNA为模板，通过合成的寡核苷酸逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA，然后用此cDNA作为模板及合成的PCR引物进行PCR扩增，扩增产物采用凝胶回收试剂盒进行快速胶回收，取回收DNA做测序反应，结束后采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳前测序PCR 产物在PCR仪上进行热变性(95°C aiiin)，冰中骤冷，基因测序仪测序；将所测序列结果与 NCBI核酸数据库进行序列比对，得出待检者HCV基因分型。本专利技术采用基因序列分析法进行HCV基因分型，和其他技术相比，操作快速，结果准确，能一次性对7种HCV基因型进行分型鉴定，涵盖了目前所报道的所有亚型，是最直观、 最准确的方法。本专利技术试剂盒的优点和有益效果如下(1)敏感测序检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性标记的荧光素对定量分子进行识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。(4)快速速度快、高通量，可在12 14小时完成。附图说明4图1丙型肝炎患者HCV靶基因片段测序结果； 图2为丙型肝炎患者HCV靶基因片段DNA序列；图3为所测基因序列与NCBI核酸数据库比对结果，即检测患者HCV基因分型结果。具体实施例方式现结合实施例对本专利技术进一步描述，但本专利技术的实施并不仅限于此。实施例1本专利技术试剂盒的制备本专利技术试剂盒的组成如下(1)丙型肝炎病毒RNA提取试剂TRIzol裂解液，氯仿、异丙醇和无水乙醇(2)引物HCV NS5B 基因上游引物序列为5，-TTAACCACATCMRCTCCGTGTG-3， HCV NS5B 基因下游引物序列为5，-GTACCTGGTCATAGCYTCCGTRAA-3‘ HCV NCR保守区域基因上游引物序列为5，-GCGGAACCGGTGAGTACA-3， HCV NCR保守区域基因下游引物序列为5，-CCTATCAGGCAGTACCACAAGG-3， 以上引物由上海Life Technology公司合成。(3)阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有HCV RNA样品为阳性对照。(4)逆转录 PCR 反应试剂200 U/μ L M_MLV、40 U/μ L RNase、50 μ M Oligo (dT)15、50 μ M Random primer (随机引物)、5 X first-strand buffer (第一链合成缓冲液)、RNase-free ddH20、10 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂盒，其特征在于，包括ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因扩增引物、ＨＣＶ ＮＣＲ保守区域基因扩增引物、ＨＣＶ ＲＮＡ提取试剂、阴性对照和阳性对照、ｃＤＮＡ合成试剂、ＰＣＲ反应液和ＰＣＲ测序试剂，其中，ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因上游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示，ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因下游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示，ＨＣＶ ＮＣＲ保守区域基因上游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３所示，ＨＣＶ ＮＣＲ保守区域基因上游引物序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，童永清，顾剑，郑红云，
申请(专利权)人：李艳，童永清，顾剑，郑红云，
类型：发明
国别省市：83
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