一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。本发明专利技术对T4噬菌体溶菌酶基因密码子组成及限制性核酸内切酶识别位点进行优化，将优化后的T4溶菌酶基因突变体lyMu与经过改造的大肠杆菌表达载体进行重组，获得重组表达载体pEly。表达载体pEly可以用于在大肠杆菌中诱导表达外源基因，在外源基因被诱导表达时T4溶菌酶也同时表达。经诱导表达的细胞经EDTA溶液处理后即自行裂解并释放出细胞内的表达产物。本发明专利技术实施后获得的表达载体可以实现多种外源蛋白在大肠杆菌宿主中的表达，宿主菌经EDTA处理释放出表达产物，有利于表达产物的回收。本发明专利技术在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及采用基因工程手段构建大肠杆菌表达载体，属于微生物、基因工程
技术介绍
大肠杆菌是现代基因工程中最常用的宿主，具有操作方便、产量高等优点，是表达外源蛋白最常用的宿主。但是大肠杆菌作为蛋白表达宿主也存在着许多缺点，其中之一是大肠杆菌表达外源蛋白时目的产物一般存在于细胞内或周质中，很少有产物能分泌到细胞外。回收胞内产物首先面对的问题就是细胞的破壁问题。大肠杆菌细胞壁外面还有一层外膜，因此使用溶菌酶进行破壁时需要添加表面活性剂破坏外膜，而表面活性剂本身就是蛋白质变性剂，会导致许多目的产物失去活性。因此大肠杆菌的破壁往往需要采用一些物理方法。但是这些方法往往存在一些固有的缺点机械设备比较昂贵，使用过程中能量消耗较大，同时其产生的机械剪切力也可能会使目的产物失活。T4噬菌体是一种大肠杆菌烈性噬菌体，在感染大肠杆菌的后期，T4噬菌体会表达两种与其释放有关的蛋白，溶菌酶和穿孔素。溶菌酶具有分解肽聚糖使细菌裂解的功能，但 T4噬菌体的溶菌酶自身不带信号肽，只存在于细胞质中无法接触到细胞壁，因此T4溶菌酶本身不能导致宿主菌的裂解。穿孔素蛋白能够改变细胞质膜的通透性，使得溶菌酶可以穿过细胞质膜进入周质空间，进而作用于细胞壁。研究发现EDTA也具有改变细胞膜通透性的功能，在进行细胞裂解时可以替代穿孔素。本专利专利技术人曾尝试将T4溶菌酶基因与嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶基因串联表达，在基因表达后期成功利用EDTA实现了宿主菌的裂解及重组过氧化氢酶的回收。然而酶活检测发现，用这一方法回收的重组过氧化氢酶只有重组菌表达的过氧化氢酶总量的50%左右。初步研究发现，裂解液中有大量的菌体没有被完全裂解，推测这一现象可能与重组菌中T4溶菌酶表达量过低有关。 对T4溶菌酶密码子组成分析显示，其结构基因中存在多个大肠杆菌稀有密码子，可能是影响蛋白表达量的重要原因。在大肠杆菌细胞中，编码精氨酸的两个密码子AGG和AGA对表达影响最大。在T4溶菌酶基因中存在3个AGA，如能将其突变为大肠杆菌常用的密码子则很可能显著提高T4溶菌酶的表达水平。本专利技术主要采用定点突变技术优化T4溶菌酶密码子组成并同时优化T4溶菌酶基因的核酸内切酶识别序列。利用经优化的突变基因构建实现大肠杆菌可控裂解的表达载体pEly。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是构建可以用EDTA或其他温和的物理和化学方法控制宿主菌裂解的大肠杆菌表达载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供既能高表达目的产物又便于产物回收的表达载体。本专利技术的技术方案1、首先利用PCR及定点突变技术，获得密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4噬菌体溶菌酶编码基因，命名为lyMu，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。其具有如下特点1)基因中不含不利于基因表达的密码子AGA ;2)基因中不含不利于载体构建的限制性核酸内切酶EcoR I和Mlu I的识别位点，有利于构建重组载体，有利于由此构建的重组载体的应用。基因IyMu的获得方法(1)位于T4溶菌酶基因两端的密码子AGA的定点突变T4噬菌体的溶菌酶基因，即T4溶菌酶基因，命名为T4 lys，其核苷酸序列为SEQ ID NO :3。对T4溶菌酶结构基因分析显示，其编码精氨酸的密码子中有3个为AGA，为大肠杆菌中对基因表达影响较大的密码子。这3个AGA密码子一个靠近基因的5’端，一个靠近基因3’端。这两个密码子可以在使用PCR方法扩增基因时直接进行突变。在靠近3’端的 AGA密码子下游含有一个Mlu I识别位点。Mlu I是基因工程中常用酶切位点，如保留在基因中会对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，因此在优化密码子的同时将其突变去除。据此设计长引物用PCR方法扩增T4溶菌酶基因，在PCR过程中实现上述突变。基因扩增产物与PMD18-T Simple载体连接，获得重组质粒。重组质粒命名为pMD_T41y。(2)位于T4溶菌酶基因中部的密码子AGA的突变位于T4溶菌酶编码区238 240位点的密码子AGA难以在基因扩增时实现突变， 本专利技术采用反向PCR方法实现定点突变。对该密码子附近序列分析显示，该基因上游有一 EcoR I识别位点。EcoR I是基因工程中最常用的核酸内切酶，如保留在基因中会对以后构建表达载体及载体的应用带来不便，本专利技术在优化密码子时将该位点一起去除。进一步分析EcoR I识别位点附近序列，如果将EcoR I识别位点上游编码Val的密码子GTT突变为其同义密码子GTC则其下游序列TCGCGG将突变为CCGCGG，即内切酶Sac II的识别位点，基因编码的氨基酸序列不会发生变化。据此设计引物将极大方便定点突变的操作。为此设计并合成一对反向PCR引物，进一步以pMD-T41y为模板进行反向PCR，扩增产物用Mc II酶切后自连接，获得重组质粒，对所获得的重组质粒测序，序列分析结果显示所获重组质粒中所设计的突变均已实现，突变后的基因命名为lyMu，重组质粒命名为pMD-lyMu。突变后的基因IyMu的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。2、控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，命名为pEly，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1。表达载体pEly的大肠杆菌转化子，分类命名为hcherichia coli/pEly，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011212，pEly载体中含有所述密码子及限制性核酸内切酶识别位点优化的T4溶菌酶编码基因lyMu。表达载体pEly的获得方法(1)表达载体pKac的改造表达载体pEtac是本专利专利技术人早期构建的大肠杆菌表达载体。这个载体以tac启动子控制外源基因表达，但在tac 启动子上游存在多个基因工程中常用的酶切位点，以此为基础构建的表达载体可能给后续应用带来不便，需要除去。pEtac2切除了原质粒中tac启动子上游BamH I和Bgl II酶切位点之间的片段，去除了 tac启动子上游多个酶切位点。(2)表达载体PEly的构建酶切质粒pMD-lyMu，电泳分离回收IyMu基因片段，与质粒pEtac2连接，获得pEly 质粒。表达质粒PEly以tac启动子控制外源基因表达，启动子下游多克隆位点含有10个可供选择的酶切位点。多克隆位点下游为T4溶菌酶基因的突变体IyMu基因，IyMu基因带有独立的SD序列，可以与外源基因共转录后独立翻译获得T4溶菌酶，通过添加EDTA等试剂可控制宿主大肠杆菌的自裂解。3、所述的控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体的应用利用pEly实现外源基因的表达并利用添加EDTA的方法实现宿主菌的裂解。材料和方法普通分子生物学方法除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等 1989分子克隆实验手册)。DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。引物均为本专利专利技术人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。克隆载体pMD18-T Simple为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。反向PCR 技术参照文献进行。Escherichia coli JM109有时简写为E. coli JM本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种控制宿主菌自裂解的大肠杆菌表达载体，命名为ｐＥｌｙ，其核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈微，范如意，王正祥，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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