本发明专利技术公开了一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其应用，是将氨基葡萄糖合成酶的基因(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)导入大肠杆菌E.coli?K-12，并敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE和甘露糖磷酸转移系统manX基因得到基因工程菌E.coli-glmS-gna1-ΔnagE-ΔmanX，该菌株用于发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点，生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产氨基葡萄糖基因工程菌及其构建方法，属于生物工程
技术介绍
氨基葡萄糖(Glucosamine, 2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一个轻基被氨基取代后的化合物。几乎存在与所有有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分。氨基葡萄糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛。因此，临床上多用于治疗骨关节炎。此外，氨基葡萄糖还具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生；在医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎和胃溃疡疾病。在食品中，是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，还是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，此外也可用于化妆品和饲料添加剂中。甲壳素水解法是我国目前生产氨基葡萄糖的主要方法，甲壳素水解法转化效率低，产生大量酸性废水，因而产品成本高、污染严重。目前，国内外对生物法生产氨基葡萄糖的报道较少，发酵产量也较低，尚未达到工业化生产的要求。在发酵过程中当碳源葡萄糖浓度较低时，氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以被细胞当作碳源利用。氨基葡萄糖依靠甘露糖磷酸转移系统(marmose PTS，IIMan，由manXYZ 操纵子编码)和葡萄糖磷酸转移系统(glucose PTS, IIg1c,由pstG基因编码)对其进行磷酸化后从胞外向胞内转运，而N-乙酰氨基葡萄糖在从胞外向胞内转运时，依靠IIMan和乙酰氨基葡萄糖磷酸转移系统(GlcNAc PTS, IInag,由基因nagE编码)对其进行磷酸化后进行转运。因此，要想在胞外积累高浓度的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖，就必须对其转运途径进行阻断，减弱氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖从胞外到胞内的转运。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高产氨基葡萄糖基因工程菌，所述重组菌为是克隆E. coli BL21(DE3)基因组中氨基葡萄糖合成酶glmS基因和酿酒酵母 S. cerevisiae S288C基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统nagE基因和甘露糖磷酸转移系统manX基因构建而成的重组大肠杆菌。所述氨基葡萄糖合成酶的基因来源于GenBank No. CP001509. 3基因组中glmS 片断，氨基葡萄糖乙酰化酶gnal基因来源于GenBank NC_001138,大肠杆菌为E. coli K-12(ATCC25947)。将氨基葡萄糖合成酶编码基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因gnal连接到载体 pET-28a(+)上。本专利技术还提供了一种构建高产氨基葡萄糖基因工程菌的方法，用限制性内切酶 Sac I和Hind III对glmS基因片断和pET48a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET48a(+)的Me I和Hind III位点之间；用限制性内切酶Not I和 Xho I对gnal基因片断和pET18a(+)进行酶切，并通过连接反应将gnal基因片断插入质粒pET48a(+)的Not I和Xho I位点之间得到重组质粒pET18a(+)-glmS_gnal。敲除 E.coli ATCC 25947基因组中nagE和manX基因片段，得到nagE和manX基因失活的菌株 E. coli-AnagE-AmanX，再将携带有 glmS 和 gnal 基因片段的质粒 pET18a (+)-glmS-gnal 转化大肠杆菌 Ε· coli-AnagE-AmanX 中得至Ij重组菌 E. coli-glmS-gnal-Δ nagE-Δ manX。所述重组菌培养环境条件培养时间为12h，温度37°C，摇床转速200rpm，待OD6tltl达到0. 6时，按照10%浓度加入乳糖(使发酵液中终浓度为5g/L)诱导glmS和gnal基因的表达。 所述重组菌培养基组成为种子培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，甘油細1，按照50μ g/ml加入卡那霉素，pH 自然。；发酵培养基蛋白胨12g，酵母膏Mg，葡萄糖10g，按照50 μ g/ml加入卡那霉素， PH自然。本专利技术采用基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，具有发酵时间短，生产强度高，生产成本低，对环境污染小，无过敏反应等优点。生产得到的氨基葡萄糖可以广泛用于医药、食品等领域。具体实施例方式1.重组质粒 pET18a(+)-glmS_gnal 的构建用于扩增glmS基因的引物上游5，-CGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG C-3，(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Me I)下游5’-CCC AAG CTTTTA CTC AAC CGT AAC CGA-3，(下划线序列表示限制性酶切位点Hind III)。氨基葡萄糖合成酶基因glmS是利用E. coli BL21 (DE3)基因组(GenBank No. CP001509. 3)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Sac I和Hind III对glmS基因片断和pET48a(+)进行酶切，并通过连接反应将glmS基因片断插入质粒pET48a(+)的 Sac I和Hind III位点之间，得到重组质粒pET48a(+)-glmS。用于扩增gnal基因的引物上游5，-AAGGAGATAAGAATGCGGCCGCATGAGCTTAC-3，(下划线序列表示限制性内切酶识别位点Not I)下游5，-CCGCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3'(下划线序列表示限制性酶切位点》ιο I)。氨基葡萄糖乙酰化酶基因gnal是利用酿酒酵母S. cerevisiae基因组(GenBankNCJK) 1138)作为模版进行PCR得到的。用限制性内切酶Not I和Xho I对 gnal基因片断和pET18a(+)-glmS进行酶切，并通过连接反应将gnal基因片断插入质粒pET-28a (+) -glmS 的 Not I 和 Xho I 位点之间，得到重组质粒 pET_28a (+) -glmS-gnal。2.nagE基因的敲除根据Ε. coli JW0665_1(该菌购自麻省理工学院，其nagE基因已经被kan插入失活)基因组序列设计上游引物5，-TACGAGAAGCCAGAGAAGACGC-3，下游引物5，-GGTGTTCAGCAAATTTAATACGG-3，该菌株信息详见:http //cgsc. biology, yale. edu/Mutation. php ？ ID = 101996扩增该菌nagE基因座及上下游约SOObp片段，将该片段转化含有质粒pKD46的 E. coliK-12，利用Red同源重组技术敲除E. coli K-12基因组nagE基因片段，再转化质粒 PCP20，去除kan片段后得到nagE基因失活菌株E. coli-AnagE。3.manX基因的敲除根据E. coli JW1806_1(该菌购自麻省理工学院，其manX基因已经被kan插入失活)基因组序列设计上游引物5，-本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种氨基葡萄糖基因工程菌，是克隆Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）基因组中氨基葡萄糖合成酶ｇｌｍＳ基因和酿酒酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ基因组中氨基葡萄糖乙酰化酶ｇｎａ１基因，同时敲除乙酰氨基葡萄糖磷酸转运系统ｎａｇＥ基因和甘露糖磷酸转移系统ｍａｎＸ基因构建而成的重组大肠杆菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，李江华，陈欣，何菊，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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