本发明专利技术提供了一种分子删除策略培育精米中无外源基因的转基因水稻的方法，该方法包括步骤：构建基于胚乳特异性表达控制的位点特异性重组系统的水稻转化载体；利用该水稻转化载体转化水稻愈伤组织，筛选、分化产生转基因水稻植株；种植转基因水稻植株，获得在胚乳中外源转基因结构已被删除，而在其它组织中外源转基因结构能稳定整合与表达并能稳定遗传的转基因水稻株系。本发明专利技术利用重组酶识别序列，有效地提高了删除的效率，最高达到100%删除的效果。本发明专利技术采用水稻胚乳特异的启动子控制技术，结合位点特异性重组酶系统自我删除的方法，能在水稻种子的胚乳部位高效特异的删除所有外源基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，更具体地涉及一种培育转基因水稻的方法。
技术介绍
农业与人类的衣、食、住、行等活动息息相关，农业生产为人类生存和繁衍提供了必要的物质基础。几千年以来，人类利用已经掌握的农业技术不断地提高作物产量和改进农产品品质，满足社会对粮食等生存必需品不断增长的需求。进入21世纪以来，在世界范围内，人口急剧增长，可耕作土地资源迅速减少，以及生态环境日益恶化。如何生产更多的粮食养活更多的人，而又尽可能减少对生态环境的破坏，已经成了全世界很多国家尤其是发展中国家必须面对的一个难题。经过长期的发展，传统育种技术已经达到一个很高的水平，但同时也达到一个发展的瓶颈阶段。利用传统农业生物技术再进一步提高粮食产量的空间有限，这将很难满足农业生产在21世纪持续高速发展的要求。上世纪80年代初发展起来的植物转基因技术，目前技术上已成熟，其应用也日益广泛。该技术已经成为世界上增加粮食产量、减少环境污染最重要的手段之一。据ISAAA (国际农业生物技术应用服务组织)2010年度报告显示，经过短短15年的商业化，2010年转基因作物累计种植面积已逾10亿公顷。1996年至2010年间，转基因作物种植的面积增长了 87倍，是现代农业史上采用速度最快的作物技术。总体上，转基因植物的发展是一种趋势。水稻作为最主要的粮食作物，规模化采用转基因技术并最终商业化也是必然的趋势。至今，转基因水稻的研究也已取得了显著的进展。多年来，转基因植物在迅猛发展的同时，也一直面临着一些争议。尽管迄今为止的研究表明转基因作物及其产物并未带来安全性隐患，但有些人仍然担心转基因植物中的外源基因结构会带来影响环境和人类健康安全性的问题。一般对于转基因植物安全性方面的考虑有两方面一是环境安全性，如转基因植物是否影响其周边环境的变化，外源基因是否可能通过花粉扩散等方式逃逸，对生态环境造成危等等；另一方面是食用安全性，如转基因的产物是否有毒性或会引起过敏反应等等。基于安全性方面的考虑，人们在研发转基因植物产品的过程中，对转基因植物执行了严格的安全性评估，另一方面，人们也在发展新的培育转基因植物的技术体系，以期从根本上解决安全性担忧的问题。基于位点特异性重组酶及其所识别位点特异性序列的分子删除策略就是近年来人们发展起来培育转基因植物的方法之一，其中一个典型的例子就是转基因植物中标记基因的删除。目前，无选择标记转基因植物的培育已经解决了人们对植物转基因系统使用选择标记基因的忧虑。位点特异性重组系统是一类能够通过对特定DNA序列进行切割和重新连接，使其发生重组的DNA重组体系。目前在植物中有效的位点特异性重组系统主要包括大肠杆菌噬菌体Pl的Ore/Ioxp系统、接合酵母的R/rs系统、酿酒酵母的Flp//ri系统和大肠杆菌噬菌体λ的Xis/aii/7系统等。其中，Cre/7o#和FLP//ri是在植物中研究的最为深入和广泛的位点特异性重组系统。这类系统目前已成为遗传操作的一种重要工具，在外源基因定点整合、基因剔除、基因诱变及基因克隆等方面都有重要的作用。Rusell等人(1992. Mol Gen Genetic. 234: 49 59)利用 Cre/Vof 系统，将一个编码磺酰脲(sulfonylurea)抗性的(acetolactate synthase, J/s)基因构建在了 A^d序列之间，在转基因烟草中，通过表达Cre酶，删除了序列之间的JZs基因。类似的位点特异性重组系统介导的策略已被广泛应用于培育无选择标记转基因植物。位点特异性重组系统介导DNA重组的效率是应用这一策略进行基因删除的关键。 鉴于常规位点特异性重组系统的效率有一定的局限性，Luo等人(2007. Plant Biotechnol J. 5:沈3-274)将和/ri两个特异识别位点融合在一起，构建成一个新的嵌合特异识别位点IoxP/frt。Luo等人在烟草中的实验结果表明，新的嵌合特异识别位点loxP/frt在重组酶蛋白Cre或FLP的介导下，其重组效率显著高于原生型A^P或/ri重组的效率。在这一新的嵌合特异识别位点hx/y/ri的基础上，Luo等人创建了一个基因删除系统。通过利用花粉或种子特异表达启动子的重组酶的表达，其能够删除转基因烟草中花粉或种子中的转基因结构，并且最高效率可达100% (Luo K, et al. 2007. Plant Biotechnol J. 5: 263 274)。总而言之，这些位点特异性重组系统的创建，使得人们能够删除转基因植物中的选择标记基因，或是特异组织中的转基因结构，从而降低人们对转基因植物安全性的忧虑。在水稻上，基因删除技术也已经被应用于转基因水稻的安全性控制中，如利用这些技术删除转基因水稻中的抗生素抗性基因等(Sreekala C. et al. 2005, Plant Cell Rep, 24，(2): 86-94)。但由于水稻是人们最主要的粮食，因此人们对其安全性的要求尤其严格。此外，目前应用于水稻中的分子删除系统效率比较低，仍然有待进一步改进。基于上述原因，本专利技术旨在提供一种高效率删除转基因水稻中稻米食用部位中外源转基因结构的新方法。本专利技术基于两个基础一是水稻是一种极其特殊的粮食作物，其种子包含胚乳和胚两个部分。其中胚乳是主要的营养部分，也是稻米的食用部分；而胚作为遗传的载体部分，它在稻米的加工过程中基本被去除干净而不会被人们所食用。二是组织特异性启动子技术和高效的位点特异性重组系统为完全删除转基因水稻中的所有外源基因提供可能。
技术实现思路
鉴于以上情况，为了培育胚乳部位无转基因结构的转基因水稻，实现通过转基因植物获得无外源基因结构的产品的目的。本专利技术提供了一种。本专利技术的培育在食用精米(胚乳)部位中去除外源转基因结构的转基因水稻的方法，包括以下几个步骤a.构建基于胚乳特异性表达控制的位点特异性重组系统的水稻转化载体。其特征在于，所述水稻转化载体含有以下元件重组酶识别序列；外源目的基因表达盒；胚乳特异性表达启动子控制的重组酶基因表达盒以及用于水稻转化筛选的抗生素抗性表达框。b.利用该转化载体转化水稻愈伤组织，筛选、分化产生转基因水稻植株。c.种植转基因水稻植株，检测外源目的基因在转基因植株中不同部位，包括根、 茎、叶、胚及胚乳中的表达水平，获得外源目的基因在胚乳中被特异性删除，而在其它组织中均稳定整合并高效表达的转基因水稻植株株系。d.种植下一代转基因水稻株系，进一步分子检测外源基因的整合及表达，获得在胚乳中外源转基因结构已被删除，而在其它组织中外源转基因结构能稳定整合与表达并能稳定遗传的转基因水稻株系。所述重组酶识别序列是指能被位点特异性重组酶特异识别并剪切的序列，包括 loxp、frt、融合 loxp-frt、RS、attP、attB、attL、attR。所述外源目的基因是指抗逆基因、抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、品质改良基因中的一种或由上述基因组成的融合或多价基因。所述胚乳特异性表达启动子是指在胚乳中特异性表达而在其它部位不表达的启动子，来源于植物物种的野生型启动子或修饰后的启动子，包括Gtl、Gluc。所述重组酶基因是表达产物能特异性识别两个位点特异序列并剪切、删除序列间片段的任何野生型重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
源转基因结构能稳定整合与表达并能稳定遗传的转基因水稻株系。及胚乳中的表达水平，获得外源目的基因在胚乳中被特异性删除，而在其它组织中均稳定整合并高效表达的转基因水稻植株；４） 种植下一代转基因水稻株系，进一步分子检测外源基因的整合及表达，获得在胚乳中外源转基因结构已被删除，而在其它组织中外子控制的重组酶基因表达盒以及用于水稻转化筛选的抗生素抗性表达框；２） 利用该水稻转化载体转化水稻愈伤组织，筛选、分化产生转基因水稻植株；３） 种植转基因水稻植株，检测外源目的基因在转基因植株中不同部位，包括根、茎、叶、胚１．一种分子删除策略培育精米中无外源基因的转基因水稻的方法，包括以下几个步骤：１） 构建基于胚乳特异性表达控制的位点特异性重组系统的水稻转化载体；所述水稻转化载体含有以下元件：重组酶识别序列；外源目的基因表达盒；胚乳特异性表达启动
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，胡太蛟，陈在杰，朱颜婷，郑雪琴，苏军，陈松彪，刘华清，陈建民，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。