抗体靶向纳米制剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗体靶向纳米制剂的制备方法。抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10∶1～8∶1；偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2∶1。本发明专利技术抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒的5-FU，不仅靶向性结合肿瘤细胞，并且使得抗肿瘤活性大大增强，并且减少了5-FU的用量，减少了5-FU的副作用，增加了病人的耐受性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体靶向纳米制剂的制备方法。
技术介绍
5-氟尿嘧啶(5-FU)是嘧啶类的氟化物，属于抗代谢类抗肿瘤药物，能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺核苷酸，干扰DNA的合成。此外尚能抑制RNA的形成，从而抑制肿瘤细胞的增殖，是临床上广泛运用的抗代谢类抗肿瘤药物，但是 5-FU有可能引起严重的消化道反应与骨髓抑制等不良反应。抗体靶向纳米制剂作为一种纳米级药物载体，在提高药物溶解度、增加药物稳定性、缓控释给药、靶向给药等方面有着广阔的应用前景。在目前的肿瘤研究中，已有药物与单克隆抗体偶联的研究报道。有研究表明，VEGF蛋白的过度表达与肿瘤血管的形成及转移有密切关系，因此以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤药物就成为了治疗肿瘤的方法之一。由于5-氟尿嘧啶的毒副作用限制了其应用，如果能靶向性使其直接作用肿瘤细胞，而少作用或不作用正常的细胞的话，那么可以减少其毒副作用，并且减少剂量，降低了患者的耐药性的风险。本专利技术提供抗体靶向纳米制剂，其包括抗血管内皮生长因子抗体与聚乳酸纳米微粒，可以有效解决现有技术难题。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术采用超声乳化-溶剂蒸发法制备纳米制剂药物，制备出了一种具有缓释作用、增加药物在体内滞留时间、具有靶向作用的抗体靶向纳米制剂。技术方案抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为10 1 8 1; 偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1。偶联剂为碳二亚胺。聚乳酸纳米微粒由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、血清白蛋白构成，其质量比为4 2 1。所述的抗体靶向纳米制剂的平均粒径小于300纳米。所述抗体靶向纳米制剂的平均粒径为230-280纳米。所述抗体靶向纳米制剂为冻干粉制剂。所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。一种抗体靶向纳米制剂的制备方法，其特征在于下列步骤组成a.配制5-氟尿嘧啶水溶液，作为内水相备用；b.称取聚乳酸溶于有机溶剂中，作为油相，将内水相在300w，3min超声条件下滴加油相中，形成乳白色的水/油初乳溶液；c.称取血清白蛋白溶于饱和的5-氟尿嘧啶水溶液中，配制成血清白蛋白水溶液作外水相，将水/油初乳溶液在300W，6min超声分散条件下滴加到外水相中，形成W/0/W复合体系；d.电磁搅拌W/0/W复合体系，使其中的有机溶剂缓慢挥发至挥发完全；获得聚乳酸纳米微粒，其中聚乳酸纳米微粒的由聚乳酸、5-氟尿嘧啶、血清白蛋白构成，其质量比为 4:2:1;e.称取质量比为10 1的聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体，溶于pH 为6. 86的缓冲溶液中，在搅拌状态下加入碳二亚胺，其中偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为2 1，4°C下搅拌2h，制得抗体靶向纳米微粒。步骤b和d中所述的有机溶剂为丙酮。步骤e中偶联剂为碳二亚胺。本专利技术的制备过程流程示意图见图1。抗血管内皮生长因子抗体的编码氨基酸序列(重链)MDWTWILFLVAAATRVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKZ抗血管内皮生长因子抗体的编码氨基酸序列(轻链)MDffTffILFLVAAATRVHSQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSZ有益效果本专利技术原理解释本专利技术采用抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒，其中纳米微粒中包含有5-FU。其中全人源抗VEGF单克隆抗体特异性结合VEGF ；而血管生成是生殖、 生长发育和修复的基础，绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。在肿瘤血管内皮细胞中，VEGF表现为上调，而正常组织中VEGF表达量很低； 因此采用抗血管内皮生长因子抗体特异性结合肿瘤细胞中上调的VEGF，实现靶向性目的； 该抗人血管内皮生长因子抗体，是中国药科大学与上海转基因研究中心合作，利用转入人免疫球蛋白基因的五特征转基因小鼠成功制备的全人源抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体，其本身具有显著的体内外抗肿瘤活性；本专利技术抗血管内皮生长因子抗体结合纳米微粒的5-FU，不仅靶向性结合肿瘤细胞，并且使得抗肿瘤活性大大增强，并且减少了 5-FU 的用量，减少了 5-FU的副作用，增加了病人的耐受性。如下是详细的说明1、从图3可知，全人源抗VEGF单克隆抗体可以在血液、心脏、肝、脾、肺和骨中，静脉给药后，其放射性迅速达到最大值，然后随着时间的延长放射性逐步降低；而在胃、肌肉、性腺和小肠中，其放射性在给药后Ih达到最大，然后在随着时间的延长而降低；脑中的放射性始终很低，表明全人源抗VEGF单克隆抗体无法通过血脑屏障。从表一可知，抗体靶向纳米微粒的抗体活性可以保存80%以上，因此，靶向纳米制剂可以在某些部位聚集，从而有效的减小全身毒性。2、5_氟尿嘧啶价格便宜并且对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌(局部涂抹)外阴白斑(局部涂抹)等均有一定疗效。 单独或与其他药物联合应用于乳腺癌和胃肠道肿瘤手术辅助治疗，也用于一些非手术恶性肿瘤的姑息治疗，尤其是那些胃肠道、乳腺、头颈部、肝、泌尿系统和胰腺的恶性肿瘤。但是由于5-氟尿嘧啶有着强烈全身毒性，如胃肠道反应与骨髓抑制，影响了其临床使用价值， 因此我们制备5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂，洗完可以减小其5-氟尿嘧啶全身毒性。由图3的结果可知，靶向纳米制剂的缓释效果为4-5天，并且靶向制剂可以在靶部位富集，缓慢释放5-氟尿嘧啶，从而达到缓释的效果。由于其在靶向部位释放5-氟尿嘧啶，靶向制剂可以大大减少5-氟尿嘧啶的全身毒性。3、制备5-氟尿嘧啶聚乳酸靶向纳米制剂，其显著的优点就是可以利用碳二亚胺 (EDC)偶联剂与抗血管内皮生长因子单本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．抗体靶向纳米制剂，其特征在于其包括抗血管内皮生长因子抗体、聚乳酸纳米微粒，偶联剂；其中聚乳酸纳米微粒与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为１０∶１～８∶１；偶联剂与抗血管内皮生长因子抗体的质量比为２∶１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘煜，王宗凯，石晨阳，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84