本发明专利技术公开了一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白及其制备方法，要解决的技术问题是提高产品的纯度、收率及安全性。本发明专利技术的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2.5PEI-U/mg，抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于98.2％，蛋白含量为51～55mg/ml。本发明专利技术采用辛酸沉淀、阴离子交换层析代替传统低温乙醇法部分乙醇沉淀步骤，将IgG始终保留在上清液中，以保持IgG的活性；采用辛酸病毒灭活与纳米膜除病毒工艺，有效地保障产品的安全性，研究表明本发明专利技术的制备方法不仅提高了产品纯度、收率和安全性，还能节省能耗和降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人免疫球蛋白及其制备方法，特别是一种。
技术介绍
巨细胞病毒CMV(Cytomegalovirus)是疱疹病毒科β属的DNA病毒，由巨细胞病毒引起的孕妇、新生儿、器官移植患者、免疫抑制患者感染死亡率可达50% 80%。巨细胞病毒人免疫球蛋白CMV-IgG因能特异中和巨细胞病毒，临床上主要用其治疗孕妇、新生儿、 免疫抑制患者及器官移植手术中弓I发的巨细胞病毒重症感染。普通人群中的巨细胞病毒自然感染率可达80%以上，从健康人群中筛选并采集含高效价巨细胞病毒IgG抗体的血浆， 采用特定的分离纯化方法制备巨细胞病毒人免疫球蛋白药物，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。目前，已上市的特异性人免疫球蛋白类药物大多采用低温乙醇法(Edwin J. Cohn, L. Ε. Strong, W. L. Hughes JR. , D. J. Mulford, J. N. Ashworthm, M. Melin and H. L. Taylor, J.Am. Chem. Soc.，68 (1946) 459-475.)进行分离提纯，该法由1946年美国哈佛大学Edwin. J. Cohn教授专利技术，通过调节工艺中的pH，蛋白浓度，温度，乙醇浓度和离子强度五个参数来实现不同蛋白的分离。长期实践表明，低温乙醇法存在以下几方面的缺陷首先，乙醇是一种蛋白变性剂，分离过程中易引起IgG结构改变而变性失活，导致效价回收率较低，还可能导致新的抗原决定簇的形成；其次，相比柱层析技术，乙醇沉淀纯化效率较低，通常需要减少蛋白回收率来达到产品的纯度要求，因此工艺过程收率偏低，产品纯度不高；再次，因分离过程通常需在低温条件下进行，还存在硬件及运行成本高，劳动强度大等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，要解决的技术问题是提高产品的纯度、收率及安全性。本专利技术采用以下技术方案一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白，所述静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于2. 5PEI-U/mg,抗-CMV效价不小于100PEI-U/ml，纯度大于 98. 2%，蛋白含量为51 55mg/ml。一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白的方法，包括以下步骤(1)FI+II+III、FII+III 沉淀制备取经酶联免疫法测定的抗-CMV高效价的人血浆，2 30°C下融浆，合并混合；①FI+II+III沉淀制备用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6. 0 6. 5， 加入95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为4 6小时，反应完毕离心或压滤分离获得FI+II+III沉淀；②FII+III沉淀制备用生理盐水调节血浆蛋白含量至45 55mg/ml，用冰乙酸调节pH至6. 8 7. 2， 加入体积比分数为95%的乙醇或无水乙醇并调节乙醇浓度至7. 5 8. 5%，反应温度为-2. 5 -2. 0°C，搅拌反应4小时，反应完毕经离心或压滤分离去除FI沉淀，获得上清液，用冰乙酸调节上清液pH至6. 0 6. 5，加入95%乙醇或无水乙醇调节乙醇浓度至20 25%，反应温度为-5. 5 -4. 5°C，搅拌反应为4 6小时，反应完毕经离心或压滤分离获得 FII+III 沉淀；(2)FI+II+III 或 FII+III 沉淀溶解FI+II+III或FII+III沉淀用0. 9 1. 1倍血浆量的pH为4. 8 5. 2、浓度为20 SOmM乙酸钠缓冲液在2 8°C下搅拌8 16小时，使沉淀充分溶解，经离心或压滤分离上清液；⑶辛酸沉淀用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按10 lOOmmol/L浓度加入辛酸，在18 25°C下搅拌反应1 3小时，经离心或过滤分离上清液；(4)辛酸病毒灭活上清液用孔径为1. 0 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa，用4mol/L乙酸或0. 5 lmol/L氢氧化钠调节滤液pH至4. 5 5. 5，补加注射用水或辛酸调节悬液辛酸浓度至20 80mmol/L，在20 30°C下搅拌1 2小时，离心或过滤分离上清液；(5)乙醇沉淀用0. 5 lmol/L盐酸或氢氧化钠调节上清液pH至4. 5 5. 5，按12 16%浓度加入95%乙醇或无水乙醇进行沉淀反应，在-4. 0 -2. 5°C下搅拌反应2 8小时，离心或压滤分离上清液；(6)超滤上清液经0. 45 μ m滤膜过滤，控制过滤压力不大于0. 25MPa,滤液用30KD超滤膜 15 20倍浓缩，经8 10倍体积pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液超滤透析，超滤后收样控制蛋白含量为25 40mg/ml ；(7)阴离子交换层析用pH为6. 0 7. 1、浓度为20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液平衡层析柱8 10柱体积，按每毫升填料不大于填料最大载量的70 80%计算上样蛋白量，上样后收集穿透液，挂柱杂蛋白经含2mol/LNaCl的pH 6. 0 7. 1的20 60mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱；(8)纳米膜除病毒过滤用0. 5 lmol/L的盐酸调节穿透液pH至4. 2 5. 0，经0. 1 μ m滤膜预过滤后，用 Novasip DV20纳米膜过滤除病毒，控制过滤压力不大于0. 25Mpa ；(9)超滤除病毒后滤液经30KD超滤膜浓缩蛋白含量至80 100mg/ml，用8 10倍注射用水超滤，超滤后收样控制蛋白含量为80 150mg/ml ；(10)配制测定超滤后原液蛋白含量，用注射用水稀释调整制品蛋白含量至51 55mg/ml， 同时按9 11%的量加入麦芽糖，用0.5 lmol/L盐酸调节pH至3. 8 4. 2。本专利技术的方法在所述配制步骤后除菌分装，经0.2μπι滤膜过滤除菌，控制过滤压力不大于0. 25MPa，按蛋白含量51 55mg/ml，效价不小于100PEI-U/ml规格分装。本专利技术的方法抽样测定分装后制品蛋白含量，抗-CMV效价，纯度，分子大小分布， 辛酸残留量，渗透压摩尔浓度的项目质量指标。本专利技术的在阴离子交换层析步骤中加入填料，填料选自DEAE Sepharose Fast Flow、TOYOPEARL DEAE 650M 或 Macro-Pr印 DEAE Media。本专利技术与现有技术的全过程低温乙醇分级分离工艺方法相比，具有的技术效果如下(1)采用了条件温和的辛酸沉淀及阴离子交换层析工艺，减少了低温乙醇沉淀的步骤，在提高产品收率的同时，能有效保持IgG的活性，提高纯度和收率。工艺过程效价回收率为40 65%，纯化倍数为5. 30 8. 14，IgG回收率大于4. 9g/L，纯度大于98. 2%，IgG 多聚体小于0. 1%。(2)工艺过程中采用了辛酸病毒灭活和纳米膜过滤除病毒工艺，能有效灭活和去除病毒，结合阴离子交换层析，工艺过程病毒降低量大于121og1(l。(3)辛酸沉淀能有效沉淀非免疫球蛋白类杂质，而IgG、IgA、铜蓝蛋白保留在上清液中，沉淀过程抗体效价回收率可达90 %以上。(4)阴离子交换层析能有效去除多聚体及酸性杂蛋白，经纯化后最终产本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种静注巨细胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于：所述静注巨细胞病毒人免疫球蛋白比活性不小于２．５ＰＥＩ－Ｕ／ｍｇ，抗－ＣＭＶ效价不小于１００ＰＥＩ－Ｕ／ｍｌ，纯度大于９８．２％，蛋白含量为５１～５５ｍｇ／ｍｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张运佳，郭采平，丁玉江，宋清爽，张信，王锦才，吴恩应，张佩，陈玉琴，李慧，黄伟荣，戴美兰，张彦鹏，王春华，罗姗，黄倩云，刘永娣，吴开永，
申请(专利权)人：深圳市卫武光明生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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