本发明专利技术属于生物技术领域，特别提供了克隆自辣椒疫霉菌的1个皱缩坏死蛋白基因PcCRN1与致病相关的研究技术，该基因表现出功能特异性，仅引起寄主叶片产生退绿症状。依据农杆菌瞬时表达及沉默技术，证明了该基因通过引起寄主叶片产生退绿症状而对寄主产生致病或破坏作用，并利用体外突变技术证明了该基因编码的1个保守基序与其功能特性有关。因此，该技术发明专利技术提供了辣椒疫霉一个对寄主有破坏作用的新基因及其研究技术，该技术发明专利技术为研制卵菌病害快速诊断与预警技术提供技术储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分子生物学领域，具体地说，本专利技术涉及一种皱缩坏死褪绿基因PcCRNl 的分离、瞬时表达、体外突变及其沉默技术方法。此外，系统证明了该基因通过引起寄主叶片褪绿而参与病菌的致病或破坏作用。
技术介绍
近年来，辣椒疫病发生危害日趋加重，抗病性鉴定及抗病育种工作进展缓慢，病害控制长期依据化防措施，农药对人类和环境污染日趋加重。因此，寻找或界定辣椒疫霉靶标致病因子，研制病害发生危害预警技术，建立病害化学药剂减量防控技术措施，有效的遏止病害发生与危害，一直是分子植物病理学领域研究的技术热点。研究表明植物病原细菌、真菌、卵菌及线虫等与寄主互作过程中，常产生一系列的调控侵染或防卫反应的效应分子，这些效应分子主要包括两类一类是胞质效应蛋白， 如RXLR效应蛋白和皱缩坏死蛋白(Crinkling and Necrosis protein :CRN)，主要通过附着胞或吸器等特殊结构进入植物活细胞；另一类是质外效应蛋白，主要分泌于胞外，并与胞外靶标和质外体表面受体发生作用。目前研究的效应蛋白主要有酶抑制剂(葡聚糖酶抑制蛋白GIPl和GIP2、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白EPIl和EPI10、半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白 EPICl 和 EPIC2)、激发子 INFl、PcF、NPP (necrosis-inducing protein)、转谷氨酰胺酶、 CBEL(Cellulose Binding, Elicitor and Lectin-like)、RXLR 蛋白家族(ATR、Avr3a 等) 和CRN蛋白家族等。Torto等人(2003年)首次于马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白cDNA数据库中发现了皱缩坏死蛋白基因(CRN)，其在农杆菌介导的瞬时表达体系中导致本氏烟产生皱缩坏死症状。CRN是一类新的效应分子，目前该类基因仅发现于疫霉属病菌基因组中，相关研究信息很少。CRN基因由若干基因成员组成，致病疫霉(P. parasitica)中含196个CRN-like 序列，大豆疫霉(P. sojae)中含100个CRN-Iike序列，橡胶疫霉菌(P. ramorum)中含19个 CRN-like序列。而且大豆疫霉中的两个CRN基因(PsCRN63和PsCRN115)，氨基酸序列同源性达95. 7%，但功能特性相反，PsCRN63可激发细胞坏死，而PsCRNl 15可抑制NPP基因引起的坏死症状，表明CRN基因成员具功能多样性。2010年，Schornack和van Damme研究证明，CRN基因序列N-端保守基序LXLFLAK与RXLR基序功能相似，均可调控效应蛋白进入植物细胞内，但在寄主与病原菌互作过程中，CRN效应分子致病机理及作用靶标等资料甚少， 至此成为分子植物病理学领域研究的热点。世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物病害，给农业生产造成了严重损失，在此基础上，以重要致病效应因子为研究对象，借助基因和蛋白操作技术，探明关键基因功能特性，创建其研究技术体系，预期研究具重要的理论与实践意义。目前无公开发表过辣椒疫霉皱缩坏死蛋白靶标基因的研究信息。
技术实现思路
基于上述的原因，本专利技术提供了 1个克隆自辣椒疫霉的皱缩坏死蛋白基因PcCRNl 及其功能分析技术，特别涉及该蛋白基因的分离、瞬时表达、体外突变及其沉默突变体制备方法，证明了该基因通过引起寄主叶片产生褪绿症状而参与了病菌的致病或破坏作用；借助基因体外突变技术验证了两个保守基序对其功能的影响作用。由此证明了该基因是辣椒疫霉菌皱缩坏死基因簇的一个重要成员，本专利技术为进一步研制卵菌病害快速诊断与预警技术提供技术储备。本专利技术提供的辣椒疫霉的皱缩坏死蛋白基因PcCRNl基因，其基因序列如Seq ID No :1所示；其蛋白质氨基酸序列为Seq ID NO :2所示。该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白仅导致寄主叶片产生褪绿症状。该基因开放阅读框含1092个碱基，编码一种含有363个氨基酸的蛋白质，分子量为41. 4kDa,信号肽含有17个氨基酸(为氨基酸序列SEQ ID NO :2中1_17氨基酸)，1个 N-糖基化位点，无内含子。该基因经NCBI-BLAST在线比对，确认其属于皱缩坏死蛋白基因。该基因的具体克隆制备方法为其步骤如下PcCRNl基因克隆具体步骤A 利用参试辣椒疫霉菌株CBS121657 (荷兰菌种保藏中心提供)提取辣椒疫霉总 RNA,反转录成cDNA ；B:通过对已报道的其它卵菌中同类基因序列比对，界定该类基因的保守基序 LQLFLAK和WL，从辣椒疫霉基因组数据库中筛选PcCRN基因，并BLAST比对分析，设计特异引物PcCRNl-F1，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No 6所示，从 cDNA中分离目的基因PcCRNl，阳性克隆测序获得基因全长序列；本专利技术所述Pcnppl基因在辣椒烟草内瞬时表达的具体步骤A 根据PcCRm基因和表达载体pGR106酶切位点，设计引物，其序列如Seq ID No 11-12所示，构建PcCRNl基因PVX表达载体，将目的基因克隆至表达载体PVX-pGR106中；B 提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C:阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片中，进行瞬时表达。本专利技术所述的PcCRm基因，其保守位点突变后在辣椒本氏烟叶内的瞬时表达的方法，具体步骤如下A 根据PcCRm基因的保守位点设计引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分别突变PcCRNl基因的保守位点LQLFLTK和WL ；B:突变序列经测序验证后，利用引物其基因序列如Seq ID Νο:13_14构建 PVX-pGR106表达载体，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利福平及卡那霉素筛选农杆菌抗性转化子；C 筛选的农杆菌转化子用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒本氏烟叶片，进行瞬时表达，检测保守位点突变效果。本专利技术所述的PcCRNl基因，其基因稳定沉默表达载体构建及其沉默菌株制备的方法，具体步骤如下A 根据PcCRNl基因和PHAM34酶切位点，设计特异引物pHCRNl-F，其序列如Seq ID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如Seq ID No 16所示，构建PcCRNl基因沉默表达载体，将目的基因克隆至沉默表达载体PHAM34中；B 制备辣椒疫霉菌原生质体，并提取重组表达质粒及标记质粒PHSPNpt，按比例混合后转化辣椒疫霉原生质体，同时以野生型辣椒疫霉菌株及仅转化标记质粒PHSPNpt菌株为对照，筛选抗G418的转化子；C 转化子再培养，诱导产生游动孢子后接种辣椒叶片进行致病性测定；D 分别提取转化子菌株及对照菌株RNA，设计PcCRNl基因特异引物RT_CRN1_F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并设计辣椒疫霉内参基因actinA特异引物R本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．辣椒疫霉菌皱缩坏死蛋白基因ＰｃＣＲＮ１，其特征在于：其基因序列如Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：１所示；其氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示，该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白仅导致寄主叶片产生褪绿症状。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张修国，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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