大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法技术

大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法，它涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。体系建立：获得组培苗；含有LbDREB基因的工程菌的活化及外源基因的转化；脱菌后获得抗性芽；抗性芽生根及移栽；再生植株进行PCR和RT-PCR检测，选取阳性植株，即完成。扩繁：大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株进行分化培养，获得组培苗；进行PCR和RT-PCR检测，取阳性的根、茎段和叶片；三、重复操作2次，即完成。本发明专利技术可实现转基因大青杨的快速培育，为大青杨优良品种的开发奠定基础；产生的后代遗传稳定性好，对于实现大青杨转基因苗木的大规模、短周期、高繁殖率和低成本的工厂化生产有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。
技术介绍
大青杨(Populus ussuriensis kom.)又名又称憨大杨、哈达杨，主要分布于黑龙江、吉林省，俄罗斯(远东地区)，朝鲜。是中国东北林区特有的乡土树种，木材轻软，材质洁白、致密、耐朽力强，是造纸及胶合板材极好的原料。大青杨的造林地多为土壤干旱瘠薄、地力衰退严重的退耕还林地，致使大青杨造林成活率低，林木生长周期长，采用常规育种技术进行新品种选育所需时间长、见效慢。在以往的大青杨研究主要集中在种源试验、种子播种、航天育种、多倍体育种等常规育种，随着现代生物技术的飞速发展，利用农杆菌介导法转基因大青杨尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡30s lmin，灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，灭菌水冲洗3 5遍，再接种到含0. 5mg/ L6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的V2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD6c 值为0. 5 1. 0，然后用移液枪吸3 5ml的菌液至离心管中，以12000r/min 的转速离心lmin，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混勻，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中， 将叶片边缘切去后切成0. 5X0. 5cm的块，并在叶脉处横切2 3刀，茎节切去两边，侵染 30min后取出叶片和茎节接种到含0. 5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和 5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3 5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20 30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0. 5mg/ L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25°C、湿度为70%、光照强度为 40 μ mol · m_2 · 每天光照16h的条件下培养1 2个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0. lmg/L 6_苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的 1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25°C、湿度为70%、光照强度为40 IOOymol · πΓ2 · s—1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDRra基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH20做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、 0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH20做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；三、重复操作步骤一和步骤二 2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。本专利技术大青杨转基因体系建立的方法，可实现转基因大青杨的快速培育，为大青杨优良品种的开发奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的大青杨新种质，使该树种的生态效益、经济效益和社会效益得到迅速、充分发挥。本专利技术大青杨转基因植株的扩繁方法，产生的后代遗传稳定性好，对于实现大青杨转基因苗木的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产和该树种的转基因植株田间试验和推广工作具有重要意义。附图说明图1为具体实施方式九中PCR扩增的电泳图，其中M表示DNA Marker DL2000, H 表示水对照，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1-13表示转基因植株Al、A2、A3、A4、 A5、A6、A7、A8、A9、A10、B5、E3和B6 ；图2为具体实施方式九中RT-PCR检测的电泳图，其中 M表示DNA Marker DL2000，H表示水对照，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1_7表示转基因植株 A1、B1、C1、D1、E1、E2 和 E3。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现 一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡30s Imin,灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，灭菌水冲洗3 5遍，再接种到含0. 5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD6c 值为0. 5 1. 0，然后用移液枪吸3 5ml的菌液至离心管中，以12000r/min 的转速离心lmin，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混勻，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中， 将叶片边缘切去后切成0. 5X0. 5cm的块，并在叶脉处横切2 3刀，茎节切去两边，侵染 30min后取出叶片和茎节接种到含0. 5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和 5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3 5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20 30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0. 5mg/ L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25°C、湿度为70%、光照强度为 40 μ mol · m_2 · 每天光照16h的条件下培养1 2个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0. lmg/L 6_苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/ L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的 1/2MS培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为７０％的酒精浸泡３０ｓ～１ｍｉｎ，灭菌水冲洗２～３遍，然后转入质量浓度为１％的ＮａＣｌＯ溶液中消毒１０～２０ｍｉｎ，灭菌水冲洗３～５遍，再接种到含０．５ｍｇ／Ｌ　６－苄氨基嘌呤、０．１ｍｇ／Ｌ萘乙酸、２０ｇ／Ｌ蔗糖和５ｇ／Ｌ琼脂的１／２ＭＳ培养基上培养一个月，获得组培苗；二、挑取一个含有ＬｂＤＲＥＢ基因的工程菌的单菌落接种到２０ｍｌ的ＬＢ培养基上培养至菌液的ＯＤ６００值为０．５～１．０，然后用移液枪吸３～５ｍｌ的菌液至离心管中，以１２０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１ｍｉｎ，弃上清后加入等体积的１／２ＭＳ培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成０．５×０．５ｃｍ的块，并在叶脉处横切２～３刀，茎节切去两边，侵染３０ｍｉｎ后取出叶片和茎节接种到含０．５ｍｇ／Ｌ　６－苄氨基嘌呤、０．１ｍｇ／Ｌ萘乙酸、２０ｇ／Ｌ蔗糖和５ｇ／Ｌ琼脂的１／２ＭＳ培养基上暗培养２天，然后用灭菌水冲洗３～５遍，再放入含２００ｍｇ／Ｌ头孢霉素的１／２ＭＳ培养基中，置于１２８ｒ／ｍｉｎ摇床上摇２０～３０ｍｉｎ，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；三、脱菌后叶片和茎节接种到含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素、２００ｍｇ／Ｌ头孢霉素、０．５ｍｇ／Ｌ　６－苄氨基嘌呤、０．１ｍｇ／Ｌ萘乙酸、２０ｇ／Ｌ蔗糖和５ｇ／Ｌ琼脂的１／２ＭＳ培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为２５℃、湿度为７０％、光照强度为４０μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１、每天光照１６ｈ的条件下培养１～２个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含０．１ｍｇ／Ｌ　６－苄氨基嘌呤、０．１ｍｇ／Ｌ萘乙酸、２０ｇ／Ｌ蔗糖和５ｇ／Ｌ琼脂的１／２ＭＳ培养基中培养至抗性芽高于３ｃｍ，然后转接于含２０ｇ／Ｌ蔗糖和５ｇ／Ｌ琼脂的１／２ＭＳ培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为２５℃、湿度为７０％、光照强度为４０～１００μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１、每天光照１６ｈ的条件下培养６天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；五、取再生植株的叶片，用ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ，以含ＬｂＤＲＥＢ基因的质粒ＤＮＡ做阳性对照，未转化植株ＤＮＡ及ｄｄＨ２Ｏ做阴性对照，进行ＰＣＲ扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良ＳＤＳ法提取阳性的大青杨转基因再生植株的ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李成浩，靳春莲，李开隆，刘桂丰，杨静莉，周晨光，刘立辉，杜佳，李春燕，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：93