本发明专利技术涉及用于IspD抑制剂筛选的试剂组，包括MEP、CTP和IspD，还包括酶反应缓冲液、离子试剂以及用于测定PPi的试剂。本发明专利技术还涉及筛选IspD抑制剂的方法。通过此方法从3000多个化合物中筛选出具有抗结核活性的杜米芬。本发明专利技术还涉及杜米芬在体内/体外抑制结核分枝杆菌的用途以及杜米芬用于制备抗结核药物的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化学药物和药物筛选领域，具体地，本专利技术涉及一种结核杆菌酶IspD 抑制剂的筛选模型，以及IspD抑制剂杜米芬用于制备抗结核治疗药物的用途。
技术介绍
结核病(Tuberculosis，以下简称为“TB”)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染性疾病，严重危害着人类生命健康。现在全球三分之一的人口已经感染了结核分枝杆菌，并且每年新增结核病病例927万例，死亡300万，成为与 AIDS、疟疾并称的三大传染病。我国是全球22个结核高负担国家之一，有5. 5亿人口感染了 TB，患者人数高达550万，居世界第二位，每天新增结核病患者4000多例。结核分枝杆菌，属于分枝杆菌属，为结核病的病原菌。结核分枝杆菌的耐药已成为当前结核病治疗中所面临的最严重的问题之一，单药耐药、多药耐药甚至严重耐药(极端耐药)的结核分枝杆菌不断出现和传播，使传统的抗TB药物失去了原有的疗效。在过去的三、四十年中，未能开发出真正有效的新型抗TB药物。而且卡介苗的保护率在发达国家也已经低于50%，在中国则更低。为了应对结核病威胁，迫切需要研制新的抗TB药物。一直以来，细胞壁是筛选抗细菌药物的首选靶点。结核杆菌的细胞壁对于其生长繁殖至关重要，在细胞壁各成分的合成与组装过程中有众多的酶系参与，潜在着多个抗结核药物的新靶点。而且其中多数的酶是人体内所不存在的，因此靶向细胞壁的药物具有较好的选择毒性。近几年的研究结果表明在某些细菌、原虫和植物体内存在一条2-甲基-赤藓糖醇磷酸(methylerythritol phosphate, MEP)途径用于合成类异戊二烯的前体物质异戊酰焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。该途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的甲羟戊酸(MVA)途径。 MEP途径合成的类异戊二烯及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，因此MEP途径已成为药靶研究的热点。将大肠埃希菌或肠沙门菌MEP途径的某一基因突变或缺失，可引起致死性突变，证实MEP途径对细菌的生存是必需的。由于MEP途径在病原体广泛存在， 而不存在于人、动物和植物胞浆中，使得催化该途径的酶成为潜在的、同时又具有选择性的分子靶位。MEP 途径共包含 8 个酶参与其中，分别为 DXS, IspC, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH, Idi0 其中 ispD(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphateCytidyltransferase,2~C~ 甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞嘧啶转移酶)为这一途径中的关键基因，负责将MEP和CTP (三磷酸胞苷)催化反应生成CDP-ME(如附图说明图1所示)。Dean Crick对该基因进行了温度敏感性突变，证明确实该基因突变结核杆菌无法存活(Hyungjin Eoh, Amanda C. Brown, Lori Buetow,et al. Brennan, and Dean C. Crick. Characterization of the Mycobacterium t uberculosis4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-d-Erythritol Synthase :Potential for Drug Development. J Bacteriol. 2007,189(24) :8922-8927)。但目前尚没有 IspD 抑制剂的报道，通过筛选结核杆菌的IspD抑制剂有可能发现全新作用机制的抗结核药物。杜米芬(Domiphen Bromide, DMB)系阳离子型表面活性广谱杀菌剂。其适用于口腔、咽喉感染的辅助治疗和皮肤、器械消毒等。目前尚没有杜米芬作为抗结核药物的报道。
技术实现思路
为了筛选IspD抑制剂，本专利技术以IspD为靶标，利用其酶学活性建立IspD抑制剂筛选模型，并评价筛选产物的抗结核活性，最终发现杜米芬具有抗结核杆菌活性。具体地，本专利技术的一个方面涉及一种筛选IspD抑制剂的组合试剂，其包括MEP、CTP、IspD 和待筛选化合物；还包括酶反应缓冲液和离子试剂，其中所述离子试剂包括MgCl2、NaF及 DTT ( 二硫苏糖醇)；此外还包括测定MEP、CTP和IspD反应所生成的PPi的试剂，所述试剂优选为β-巯基乙醇和钼酸铵。其中所述IspD是从能够产生IspD的生物中提取获得或者根据上述生物的基因组序列利用分子生物学方法获得。优选地，IspD是从结核分枝杆菌中提取获得或者根据结核分枝杆菌基因组序列利用分子生物学方法获得。在本专利技术的一个实施方案中，以结核杆菌H37Rv基因组为模版，分别以5’_GTTCAT CCATATGGTCAGGGAAGCGGGCGAAGTAGTTGCG-3’ (SEQ IDNO 1)和 5’-GTCTTATCTCGAGCCCGCGCAC TATAGCTTGGGCCAGC-3’ (SEQID NO 2)为引物，通过PCR扩增得到ispD基因序列，克隆并转化，得到可高效表达结核杆菌IspD蛋白的大肠杆菌B121 (DE3)，IPTG诱导蛋白表达，取表达产物纯化，用于筛选。本专利技术的另一方面涉及筛选IspD抑制剂的方法。该方法的基本原理为IspD催化结核杆菌细胞壁合成前体CDP-ME的合成(图1)， 反应过程中，在生成Imol的产物⑶P-ME的同时释放出Imol的焦磷酸(PPi)，PPi生成量直接反映出该酶促反应进行的情况，因而可间接地反映IspD的活性。PPi生成量的测定可采用放射性方法，将CTP最后一个单磷酸进行放射性标记，通过反应生成的PPi的放射性强度检测反应进程，但该方法有放射性污染，不适于大规模使用；也可采用无机磷酸酶将PPi分解为单磷酸，然后利用显色反应检测，此方法的缺点是该过程中引入了另外的酶，需要反向筛选排除假阳性，增加了筛选步骤。在本专利技术中，PPi的测定优选采用吸光度法，反应依据为在酸性条件下，焦磷酸根与钼酸铵在巯基乙醇存在时形成蓝色产物，该蓝色产物的吸收值与本底(黄色)吸收值的差值在一定范围内与产物生成量呈线性关系，此法可简便可信的检测PPi的生成量( Kuang, NicolasSalem, Fangjing Wang, et al. A Colorimetric Assay Method toMeasure Acetyl-CoA Synthetase Activity !Application toffoodchuck Model of Hepatitis Virusinduced HepatocelIularCarcinoma. J Biochem Biophys Methods. 2007,70(4) 649-655.)。该方法包括以下步骤a.将CTP、MEP、IspD、待筛选化合物、酶反应缓冲液和离子试剂混合，组成反应体系，孵育，同时设立阳性对照和阴性对照组；b.进一步加入β -巯基乙醇和钼酸铵，孵育，检测反应体系的光吸收值，得出IspD酶活性；c.根据光吸收值计算待筛选化合物对IspD活性的抑制率，进本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓糖醇－４－磷酸胞嘧啶转移酶抑制剂筛选的试剂组，包括２－甲基－赤藓糖醇磷酸、三磷酸胞苷和２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓糖醇－４－磷酸胞嘧啶转移酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖春玲，高鹏，杨延辉，熊小椒，关艳，甘茂罗，郝雪秦，刘忆霜，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11
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