融合表达重组制备人β干扰素制造技术

本发明专利技术公开了一种在大肠杆菌中利用融合表达重组制备可溶性人β干扰素的工艺，其中包含融合表达的重组质粒和专一性蛋白酶酶切位点，以及重组制备中不含SDS的工艺方法。经本发明专利技术制备的重组人β干扰素具有更高的抗病毒比活性和安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA重组技术和药物领域，涉及通过融合表达的重组人β 干扰素，含编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。
技术介绍
人β干扰素是成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广泛生物学活性，包括抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用的重要细胞因子(KozovsKa ME, et al. Neurology (J), 1999,53 :1692-1697)，具有 5 个 α 螺旋结构和 22KDa 的分子量 (Arduini, et al. Protein Science〔J〕，1999，8 :1867-1877)。目前人 β 干扰素分为 β 干扰素-Ia和β干扰素_lb，其中β干扰素-Ia是天然结构，包含有糖基化结构。而β 干扰素-Ib是将17位的Cys突变成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由165个氨基酸组成(Goodkin DE, et al. Lancet〔J〕，1994，344 :1057-1060)。大量研究表明，人 β 干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达(JacobsL，et al. Curr Opin Neuro (J), 1994, 7 =250-254) 0 1993年以来国外已批准多种重组β干扰素上市用于治疗多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)。国外用于临床的IFN-β有IFN-β-Ia和IFN-β-Ib两种类型，均系基因重组产品。β干扰素作为治疗多发性硬化症的药物已经在国外上市的有先灵公司的Betaferon、 诺华欧化公司的Extavia以及雪兰诺公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先灵公司的Betaferon和诺华欧化公司的Extavia属于IFN-β _lb，通过在E. coli中以包涵体形式表达的重组人β干扰素-IbGer17)，工艺中需经SDS变性后再复性。而雪兰诺公司的Rebif 和 Biogen 公司的 Aronex 是通过 CHO (Chinese hamster ovary)表达的重组人 IFN-β-la。 重组IFN-β-Ib和IFN-β-Ia在结构与生物活性方面存在明显的差异，主要表现为CHO表达的IFN-β-Ιει的体外抗病毒比活性高于大肠杆菌包涵体表达制备的IFN-β-Ib (Laura Runkel,et al. Pharmaceutical Research〔 J〕，1998，15 :641-649)。IFN-β-Ib 在重组制备中需采用SDS进行变性处理后再进行复性，对人体具有潜在的毒性风险。本专利技术提供了一种制备IFN-β的新方法，实现了人IFN-β经大肠杆菌表达和重组制备中无需SDS变性复性，制备的IFN-β具有更高的体外抗病毒活性。专利技术目的目前人β干扰素-lb(IFN-β-lb) 以包涵体的形式表达，工艺中需用SDS先变性后再复性，制备工艺相对复杂，且含有SDS的残留，其抗病毒比活性仅为2X107IU/mg。本专利技术以TRX-Linker-IFN-β融合表达的方式，实现了可溶性形式表达，通过在 TRX与IFN-β之间设计不同蛋白酶酶切位点，能高效专一的切除并分离融合蛋白TRX后， 再进一步纯化制备重组人β干扰素。为了有利于表达的融合蛋白的纯化，在连接肽中引入 6XHis标签。工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，通过M柱纯化回收融合蛋白，经特定的蛋白酶酶切后通过反相C18柱纯化、离子交换和Superdex-75凝胶柱层析，制备的重组人β干扰素抗病毒生物学比活性达到5. OX 107IU/mg以上。本专利技术的目的在于提供一种以融合方式表达的重组人β干扰素蛋白并进行有效的重组制备。还提供了编码所述融合表达的人β干扰素蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的提供一种无需复性的制备工艺，获得抗病毒比活性更高的重组人β干扰素的方法。本专利技术的另一目的是提供一种可用于治疗病毒性疾病如病毒性丙型肝炎或乙型肝炎，或者免疫性疾病如多发性硬化症的重组人β干扰素。专利技术概述在本专利技术的第一方面，提供了一种融合表达重组人β干扰素蛋白的上游构建体系，它包括通过与TRX融合表达的重组人β干扰素，更具体的，该融合蛋白中包含不同的Linker，在Linker中设计不同的蛋白酶酶切位点，包括EK、TEV、thrombin、凝血因子fe等。还提供了所述人β干扰素的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，其第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)。在本专利技术的第二方面，提供了编码本专利技术上述的人β干扰素蛋白DNA分子。在本专利技术的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及构建该表达载体的方法。在本专利技术的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。在本专利技术的第五方面，提供了一种重组产生本专利技术融合表达人β干扰素蛋白的方法，它包括以下步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所述的融合蛋白；分离纯化所述的融合蛋白的方法。在本专利技术的第六方面，提供了一种重组产生本专利技术融合蛋白，通过不同蛋白酶酶切的方法，以及分离纯化人β干扰素蛋白的方法。在本专利技术的第七方面，提供了一种该重组人β干扰素蛋白的药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。至此已对本专利技术进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本专利技术进行限制。附图说明图1 重组质粒pET-32a-EK_IFN-0构建示意图。图2 重组质粒(pET-32a-EK-IFN-β )双酶切验证(1-3 =KpnI和HindIII双酶切质粒 pET-32a-EK- β -IFN 4 :PCR 片段(EK-IFN- β )。图3 :Α =SDS-PAGE检测融合蛋白TRX-EK-IFN-β的表达水平(1 诱导前；2-5 诱导后)；B =SDS-PAGE分析Ni柱的纯化效果(1 =Ni柱上样；2 :20mM咪唑洗脱；3 :200mM咪唑洗脱)。图4 融合蛋白TRX-EK-IFN-β的EK酶酶切(1 未酶切；2 酶切16小时)。图5 =A =SDS-PAGE分析制备的目的蛋白IFN-β ；B =RP-HPLC分析制备的目的蛋白 IFN- β。图 6 改造质粒 pET-3h(-thrombin-S · Tag)(代号mpET_32a)改造示意图。图7 改造质粒 pET-3h(-thrombin_S · Tag)双酶切验证(1 :XbaI 和 KpnI双酶切pET-3h质粒；2 =PCR片段TRX_6XHis ；3-5 =XbaI和KpnI双酶切质粒 pET-32a(-thrombin-S · Tag))。图 8 重组质粒 pET-3h-thrombin-IFN-3 -Gly1 构建示意图。图9:重组质粒(pET-SZa-thrombin-IFN-^-Gly1)双酶切验证(1: KpnI 和 HindIII 双酶切质粒 pET-32a-thrombin_IFN-β-Gly1 ;2 :PCR 片段 (thrombi本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在大肠杆菌中可溶性融合表达人β干扰素和重组制备方法，其特征在于：融合蛋白标签为硫氧还原蛋白（ＴＲＸ），融合表达方式为：ＴＲＸ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩＦＮ－β，其中ＴＲＸ位于Ｎ末端，ＩＦＮ－β位于Ｃ末端，中间由连接肽Ｌｉｎｋｅｒ相连。

【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中可溶性融合表达人β干扰素和重组制备方法，其特征在于融合蛋白标签为硫氧还原蛋白(TRX)，融合表达方式为=TRX-Linker-IFN-β，其中TRX位于N末端，IFN-β位于C末端，中间由连接肽Linker相连。2.权利1中所述人β干扰素序列(SEQID NO :1)，第1位氨基酸前可带有甲硫氨酸 (Met)或甘氨酸(Gly)。3.权利要求1中所述的重组融合蛋白中连接肽(Linker)含有专一性的蛋白酶切位点。4.权利要求1、3中所述重组融合蛋白中连接肽含有位于蛋白酶酶切位点前的6XHis 标签。5.权利要求3、4中所述蛋白酶切位点可以是肠激酶酶切位点DDDDK，或凝血酶酶切位点LVPRGS，或TEV酶酶切位点E...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘日勇，李祥，陈海容，谭克海，胡春兰，
申请(专利权)人：重庆富进生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：85