本发明专利技术涉及Nkx2.5在制备保护心肌细胞的药物中的用途。具体地，本发明专利技术提供了转录因子Nkx2.5增强心肌细胞对凋亡应激的抵抗力的新用途，以及Nkx2.5在维持正常状态下心肌细胞稳态中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及出生后的心肌细胞的保护。具体地，本专利技术提供了转录因子Nkx2. 5增强心肌细胞对凋亡应激的抵抗力的新用途，以及Nkx2. 5在维持正常状态下心肌细胞稳态中的用途。
技术介绍
心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)是全球第一杀手，世界卫生组织 (WHO)的统计显示，每年大约17，000，000人死于心血管疾病，占全球死亡总人数的30%。 一般认为心血管疾病多见于发达国家，但是最近几年在发展中国家也呈现了明显的增加趋势。在心血管疾病众多危险因素中，年龄因素是最为突出的一个。随着我国快速步入老龄化社会，心血管疾病在我国重大疾病中所占的比重也必然会迅速增加，对心血管疾病的临床及基础研究也日益受到国家的重视。在所有心血管疾病中，心脏相关疾病占有十分重要的位置，这其中又包括先天性心脏发育疾病和出生后心脏相关疾病。在过去的数十年中，大量积累的证据表明，心脏特异性的转录因子控制着心脏基因的程序性表达，并且在心脏发生和成年心脏的适应性过程中，发挥着关键的作用。Nkx2. 5 是NK同源盒基因家族中的一员，该家族作为DNA结合的转录激活子在进化中高度保守。NK 同源盒基因家族的四个基因最早是在果蝇中被鉴定发现的(NK1，NK2, NK3, NK4)，在那之后被划分成两个亚家族，NK-I (NKl及其类似物)和NK-2 (NK2, NK3, NK4及其类似物)(Harvey 1996)。通常认为，Nkx2. 5在心脏发育过程中起到十分关键的作用，在整个心脏发育的网络中处于枢纽性位置。Nkx2. 5在心脏传导细胞发育过程中表达会升高，提示其在心脏传导系统的发育中有重要的作用。Nkx2. 5敲除的小鼠表现为早期的胚胎致死，原因是由于心管形变过程的停止以及生长停滞。在出生后以及成年后的心脏中，Nkx2. 5的作用研究甚少，有研究发现其心肌肥厚时被上调，表明它有可能在心肌肥厚的转录调控中发挥了作用；另外， Nkx2. 5在高度分化的心肌细胞中的作用可能还包括维持细胞稳态，但是也有想证据表明过度表达的Nkx2. 5会改变心脏结构造成转基因小鼠的死亡。因此，Nkx2. 5在出生后心脏中的作用仍然很不清楚，有待于进一步深入探索。
技术实现思路
本专利技术涉及Nkx2. 5在出生后以及成年后的心脏中的用途。在一个方面，本专利技术提供了转录因子Nkx2. 5增强心肌细胞对凋亡应激的抵抗力的新用途。在一个具体实施方式中，本专利技术提供了 Nkx2. 5在制备用于抑制外部因素诱导的心肌细胞凋亡的药物中的用途。优选地，所述心肌细胞凋亡是多柔比星(DOX)诱导的凋亡。在一个具体实施方式中，所述心肌细胞凋亡是双氧水、百草枯(paraquat)、依托泊甙 (etopside)诱导的细胞凋亡。本专利技术人发现，在心肌细胞系H9C2以及原代心肌细胞中，经过DOX处理之后，Nkx2. 5的表达均呈现出先高后低的趋势。使用表达小鼠野生型Nkx2.5的重组腺病毒AdNkx2. 5实现了大鼠原代心肌细胞中Nkx2. 5的过表达。过表达Nkx2. 5的大鼠细胞经DOX处理之后，切割的caspase 3蛋白呈现梯度性降低，这表明细胞凋亡程度降低。因此，Nkx2. 5的过表达对心肌细胞具有保护作用。另外，使用其它多种不同的凋亡诱发因子获得了相似的结果，从而表明Nkx2. 5过表达具有广泛的保护作用，可以保护多种应激导致的细胞凋亡。在另一个方面，本专利技术提供了 Nkx2. 5在维持正常状态下心肌细胞稳态中的用途。 在一个具体实施方式中，本专利技术提供了 Nkx2. 5在制备保护心肌细胞的药物中的用途。本专利技术人使用包含特异性靶向大鼠Nkx2. 5的MicroRNA的腺病毒AdMiNKXl_4感染大鼠心肌细胞。在没有外部凋亡刺激的情况下(即正常状态下)，Nkx2. 5的干扰影响了心肌细胞的生存。在干扰Nkx2. 5之后再以DOX处理，则发现心肌细胞更容易发生凋亡。这些结果表明， Nkx2. 5对于维持正常状态下心肌细胞的生存具有重要意义。附图说明图1.超负荷诱导的大鼠心肌肥厚中Nkx2. 5蛋白的表达上调。图IA为western 检测结果；图IB为定量比较。Nkx2. 5的表达按照GAPDH校正。 < 0. 01。图2. DOX处理的成肌细胞H9C2中Nkx2. 5表达随时间的改变。图3.腺病毒介导的Nkx2. 5在原代新生大鼠心肌细胞中的过表达。图3A为RT-PCR 检测结果；图!BBSwestern检测结果；图3C为定量比较。图4.腺病毒介导的Nkx2. 5RNA干扰。图4A显示包含序列2的腺病毒毒株MiNKX_2 对大鼠内源性Nkx2. 5的表达有明显的抑制作用。图4B显示增加此病毒株的MOI再次做感染和WfesternJi Nkx2. 5干扰效果更为明确。图5. DOX处理的成肌细胞H9C2中Nkx2. 5表达的改变。显示Nkx2. 5的蛋白表达在早期他之前会有一定程度的上调，之后到12h出现明显下调，24h-4 !到达最低值；与此同时切割的caspase 3的蛋白水平则随着Nkx2. 5的表达下调逐渐增加。图6. Nkx2. 5的过表达保护心肌细胞对抗DOX诱导的细胞凋亡。图7. Nkx2. 5的过表达在细胞水平上保护心肌细胞对抗DOX诱导的细胞凋亡。图 7A为hoechst染色后的照片；图7B为定量比较。图8. Nkx2. 5的过表达保护心肌细胞对抗多种促凋亡试剂诱导的细胞凋亡。图9. Nkx2. 5的敲除使心肌细胞在分子水平上对DOX诱导的细胞凋亡更加敏感。图 9A显示Ad-miNeg组细胞在4 前切割的caspase 3水平没有明显的改变；但是在Ad-miNKX 组48h时就明显发生了切割的caspase 3的水平升高。图9B显示相对于阴性对照组， Nkx2. 5干扰组心肌细胞更易发生凋亡。图10. Nkx2. 5的敲除使心肌细胞在细胞水平上对DOX诱导的细胞凋亡更加敏感。 图IOA为hoechst染色后的照片；图IOB为定量比较。具体实施例方式一、实验材料1.质粒野生型小鼠Nkx2. 5 表达质粒由 iTokyo Institute of Technology 的 Ishikawa 教授惠赠；包含大鼠Nkx2. 5特异性干扰microRNA的pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR载体质粒购自 Invitrogen公司；重组腺病毒的pShuttleCMV、pAdtrack-CMV和pAdeasy质粒由本专利技术人构建；各质粒均经限制性内切酶消化电泳分析末端测序，结果经网上检索，确认质粒无误。2.抗体anti-Nkx2. 5、anti-GAPDH 购自 Santa Cruz 公司；anti-切割的 Caspase3 抗体购自Cell Signaling公司；anti-β actin抗体购自Sigma公司；anti-HRP标记的IgG和各种二抗均购自北京中杉生物技术有限公司。3.实验用大鼠清洁级新生(1-3天)的Sprague-DawIey(SD)大鼠，正常健康，雌雄不限，由军事医学科学院动物中心提供。所有动物实验都按照中国医学科学院实验动物管理条例进行。4.其他主要试剂和试剂盒重组腺病毒Ad-GFP、Ad-Nkx2. 5和本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．Ｎｋｘ２．５在制备用于抑制外部因素诱导的心肌细胞凋亡的药物中的用途。
【技术特征摘要】
1.Nkx2. 5在制备用于抑制外部因素诱导的心肌细胞凋亡的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的外部因素为多柔比星。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的外部因素为双氧水。4.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘德培，鲁云彪，陈厚早，梁姝颋，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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