本发明专利技术公开了一种制备饲养层细胞的方法。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)将离体的成纤维细胞用10μg/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括0至2次的如下步骤：将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。本发明专利技术提供的制备饲养层细胞的方法流程简单、经济、效果可靠。经人胚胎干细胞培养实验表明，利用本方法制备的饲养层细胞能够长期传代，并能有效的支持人胚胎干细胞的生长并使其保持未分化状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
饲养层细胞是用特定的细胞(如皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞等)经射线照射或丝裂霉素-C等阻断有丝分裂处理后制备的单层细胞，饲养层细胞能分泌成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，促进胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ES细胞)的增殖，同时也能分泌白血病抑制因子(Leukemia inhibitory {actor, LIF)等细胞分化抑制因子，抑制ES细胞的分化。ES细胞是从胚胎内细胞团或原始生殖嵴中分离，经体外抑制分化培养获得的一种高度未分化的具有多发育潜能性的细胞系。ES细胞对体外培养条件要求极为严格，饲养层的质量好坏直接关系到ES细胞的分离成功与否。小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性，故而常用于ES 细胞的体外分离培养，是各实验室开展干细胞研究的前提，是干细胞研究不可缺少的环节。 目前小鼠胚胎成纤维细胞fmouse embryonic fibroblast，MEF)制备饲养层主要使用的方法有、射线照射或者使用丝裂霉素C处理。、射线的优点是可大批处理MEF细胞，但是一些小的实验室不具备实验条件。因此多数实验研究均采用丝裂霉素C处理MEF来制备饲养层。但是，目前分离培养饲养层细胞的方法大多数属于经验性，制备过程繁琐，工作量大，细胞处理的方法、条件尚无确切的规程和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的制备饲养层细胞的方法，包括如下步骤(1)将离体的成纤维细胞用10 μ g/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤(1)和所述步骤( 之间还包括0至2次的如下步骤将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。所述步骤(1)中，所述成纤维细胞(离体的)具体可在含10 μ g/ml丝裂霉素C的完全培养基中进行所述处理。所述完全培养基可为任何市售的用于细胞培养的完全培养基，具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述步骤(1)，和/或所述步骤O)，和/或所述步骤⑴和所述步骤⑵之间的步骤中，所述处理的条件具体可为37°C、5% CO2培养箱中培养2.证。在进行所述方法前，所述成纤维细胞可先进行传代；用传代后的成纤维细胞(离体的)进行所述步骤(1)，和/或所述步骤O)，和/或所述步骤(1)和所述步骤( 之间的步骤。所述传代的方法具体如下将所述成纤维细胞(离体的)进行消化后培育2-4天 (如2-3天)，然后进行(1 3)-(1 幻传代。所述传代的次数具体可为2-5次(如3-5 次)，优选为3次。所述成纤维细胞(离体的)进行所述消化后培育2-4天后达到的细胞密度具体可为 80-90% ο所述方法还可包括将所述贴壁细胞进行消化的步骤。所述方法优选包括如下步骤将每一步骤得到的所述贴壁细胞消化后立即于4°C 放置30分钟，然后置于-80°C。进行所述4°C放置之前，所述贴壁细胞具体可用完全培养基重悬并与4°C预冷的2X冻存液等体积混合。所述完全培养基具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)FBS，2mmol/L glutamine。所述2X冻存液具体可由DMEM培养基和如下溶质组成10% (体积比)DMS0，10% (体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。所述成纤维细胞(离体的)具体可为小鼠胚胎成纤维细胞(离体的)。所述饲养层细胞具体可为用于培养胚胎干细胞的饲养层细胞以上任一所述方法得到的饲养层细胞也属于本专利技术的保护范围。所述饲养层细胞可用于培养胚胎干细胞，如人胚胎干细胞。本专利技术提供一种较为简捷易掌握的饲养层制备方法，为培养ESC、iPS细胞并开展相关研究奠定了基础。利用该方法制备成纤维细胞饲养层，既简化了实验操作，又节省了实验费用。丝裂霉素C作为一种细胞分裂抑制剂，同时也属于剧毒化学药品，应尽量减少用量。本专利技术提供的方法中，丝裂霉素C可重复利用2-4次，节约了成本，减少了剧毒药品的用量。本专利技术提供的方法中，细胞传代不用计数，通过比例及细胞状态来控制，克服计数主观性及不准确性，每次传代及丝裂霉素C处理细胞都处于最好状态，传代间隔2-4天，细胞状态不好及时丢弃，不再进行丝裂霉素C处理及冻存，防止浪费试剂耗材，同时减小对后期实验的影响。本专利技术提供的方法中，冻存细胞时尽量减少常温状态冻存液与细胞接触时间， 这对得到的饲养细胞质量至关重要。本专利技术提供的制备饲养层细胞的方法流程简单、经济、效果可靠。经人胚胎干细胞培养实验表明，利用本方法制备的饲养层细胞能够长期长活，并能有效的支持人胚胎干细胞的生长并使其保持未分化状态。附图说明图1为实施例1中内细胞团接种后第7天的照片(尼康倒置显微镜(TS-100_F)40 倍)。图2为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片(尼康倒置显微镜 (TS-100-F)40 倍)。图3为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天的碱性磷酸酶染色结果(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图4为实施例1中人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。4图5为实施例1中人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞染色体核型。图6为实施例2中将步骤(7)得到的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的照片(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图7为实施例2中将步骤⑶得到的细胞作为饲养层细胞，人胚胎干细胞第5次传代后第5天的碱性磷酸酶染色结果(尼康倒置显微镜(TS-100-F) 40倍)。图8为实施例2中人胚胎干细胞第5次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。图9为实施例2中人胚胎干细胞第10次传代后第5天检测细胞全能型相关细胞因子的(nanog，Oct-4, SSEA-3)表达情况。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。丝裂霉素C 液(MitomycinC)购自 Sigma，货号为 M^87。PBS 缓冲液购自 GIBC0，货号 14190-144。完全培养基由DMEM培养基(购自Invitrogen，货号11960-044)和如下溶质组成10% (体积比)FBS (购自 Invitrogen,货号 12484028)，2mmol/L glutamine (购自 Chemicon，货号 TMS-002-C)。人胚胎干细胞培养液由Knockout DMEM(Invitrogen，10829018)DMEM 培养基和如下溶质组成15% (体积比)Knockout Serum R 印 lacer (KOSR) (Invitrogen ；货号 0828-028) ,5 % 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备饲养层细胞的方法，包括如下步骤：（１）将离体的成纤维细胞用１０μｇ／ｍｌ丝裂霉素Ｃ处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；（２）将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；在所述步骤（１）和所述步骤（２）之间还包括０至２次的如下步骤：将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔杰，闫丽盈，于洋，李蓉，严杰，张妍，靳红艳，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：11
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