本发明专利技术涉及从样品中分离人forkhead?box?P3(Foxp3+)CD4+调节性T细胞(在本文称作Foxp3+Treg细胞)的方法，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体或者(iii)含有淋巴细胞的组织；本发明专利技术还涉及分离人Foxp3+Treg细胞的试剂盒以及抗CD49d抗体用于分离人Foxp3+Treg细胞的应用。
【技术实现步骤摘要】
快速分离人Foxp3+ Treg细胞的方法和试剂盒本申请为2010年05月31日提交的申请号为2008801185258标题为“快速分离人 Foxp3+Treg细胞的方法和试剂盒”的申请的分案申请本专利技术涉及从样品中分离人forWiead box P3 (Foxp3+) CD4+调节性T细胞(在本文称作R)Xp3+Treg细胞)的方法，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体或者(iii)含有淋巴细胞的组织；本专利技术还涉及分离人i^oxpS+Treg细胞的试剂盒以及抗⑶49d抗体在分离人R)xp3+Treg细胞中的应用。
技术介绍
Foxp3+调节性T细胞或者“Treg”是控制多种免疫应答的基础，其中Treg可迅速抑制其它免疫细胞的活性。特别地，Treg通过下调对自身和非自身抗原的非所需免疫应答而对于维持耐受性是至关重要的(见例如R)ntenot，J.D. &Rudensky，A.Y.Nat Immunol 6， 331-7(2005) ；Sakaguchi，S.，Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) 例如，在多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(TlD)、银屑病、重症肌无力(MG)及其它自身免疫疾病的患者中已发现 Treg 缺陷(Baecher-Allan，C. &Hal Ier，D.A. ,Immunol Rev 212, 203-16 (2006)) 在特异反应性和过敏性疾病中也存在类似关联(Robinson，D. S.，Larche, M. &Durham, S. R.，J Clin Invest 114，1389-97 (2004))。对于所有这些疾病均存在指向患者Treg细胞的降低的体外免疫抑制的报道。这已导致对于在治疗或者预防慢性感染、自身免疫疾病、过敏和移植相关并发症如移植物排斥或者移植物抗宿主疾病的免疫治疗中使用Treg的可能性的日益增长的兴趣(GvHD)(见 Roncarolo，M.G. &Battaglia，M.，Nat Rev Immunol 7，585-98 (2007)中的综述)。在人和啮齿动物中，Treg细胞组成了大约2-10%的⑶4+T细胞并组成性表达 ⑶25、CTLA-4和GITR以及参与其发育和功能的转录因子R)xp3。Treg细胞的特征性标记是Foxp3。用于分离人R)xp3+Treg细胞的方法是已知的。例如，Hoffmann，P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12,267-74(2006)中描述了在优质生产规范(GMP)条件下通过使用两步磁性细胞分离方案从标准白细胞采集物(leukapheresis)产物中分离具有调节功能的⑶4+⑶25+ T细胞。所产生的细胞产物含有平均49. 5%的R)xp3+Treg细胞。而且， 商业试剂盒如Miltenyi Biotec的CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒或者hvitrogen 的Dynal CD4+CD25+Treg试剂盒也是可用的。迄今为止所描述的所有分离人R)xp3+Treg细胞的方法均使用基于Treg细胞表面标记的对i^oxpS+Treg细胞的阳性选择(见例如％(1肚1^，N. et al.，J Exp Med 203， 1693-700(2006)).也就是说，通过使用与Treg相关的细胞表面标记主要是⑶25的抗体来分离细胞。但是大多数Treg细胞表面标记如CD4和CD25并非局限于Treg。 例如，常用的⑶25并不是在所有R)xp3+Treg细胞上均存在，其在效应和记忆⑶4+T细胞上也表达(见例如 Baecher-Allan, C, Brown, J. Α. , Freeman, G. J. &Haf ler, D. A. , J Immunol 167，1245-53 (2001))。因此，上述这些阳性选择方法不能分离占R)xp3+Treg细胞大多数的均一细胞群；Hoffmann，P.等获得平均49. 5%的R)xp3+Treg细胞。目前方法的另一缺点是分离的Treg亚群中有效应T细胞的污染。后者代表有害反应的固有风险，因其通过分泌细胞因子如IFN-γ或者IL-17来驱动促炎免疫反应。当采用标记如⑶25时，这些污染可以严重到高达一半的所分离的⑶4+细胞群包括效应T细胞 (Hoffmann, P.et al. Biol Blood Marrow Transplant 12,267-74(2006)) 另外，在细胞治疗中，对于基于Treg细胞表面标记的阳性选择而分离的 Foxp3+Treg细胞的应用会造成严重问题。首先，基于细胞表面标记如CD25对i^oxpS+I^eg 细胞的分离导致R)Xp3+Treg细胞群或多或少地被其它细胞如代表Treg抑制的主要靶的 ⑶4+效应细胞所严重污染。因此，如果这种阳性选择的R)Xp3+Treg细胞被应用于细胞治疗中，将会存在高风险，因其可导致所治疗的患者的免疫系统被潜在地致命性激活。这种致命性的免疫应答最近在“Tegenero”实验的失败中有记载，其中预期使Treg细胞扩展的抗体导致效应细胞激活(Suntharalingam，G. et al.，N Engl J Med 355,1018-28 (2006)) 其次，已经用抗体标记的阳性选择的R)xp3+Treg细胞可呈现出受损的功能。例如，用抗体标记的细胞被潜在地预先激活，可经受补体-或者细胞-介导的耗竭或者呈现出改变的归巢 (homing)和迁移模式。因此，在其分离期间被抗体定靶向的R)Xp3+Treg细胞在治疗性的应用中并不合意，而这不仅仅是出于安全原因。正如所讨论的那样，上述方法和试剂盒对于分离R)Xp3+Treg细胞显示出主要缺点。首先，目前分离免疫抑制性R)Xp3+Treg细胞的方法不能有效地去除污染CD4+效应和记忆T细胞。这是因为目前使用的技术和标记如基于⑶25的R)Xp3+Treg的分离不能将这些污染⑶4+效应和记忆T细胞与免疫抑制性R)xp3+Treg细胞区分。例如，⑶25是也存在于这些污染⑶4+细胞上的标记。此外，至少若干这些污染⑶4+细胞甚至不能通过细胞内 Foxp3染色区分，因为激活的人CD4+效应细胞已知可瞬时表达R)xp3 (Allan et al.，Int Immunol. 19 :345-54 (2007))。因此，即使通过目前方法所分离的高纯度的CD25highCD4+T 细胞群也含有相当部分的可产生细胞因子的促炎效应细胞(Dieckmarm et al. , J. Exp Med. 193，1303-1310 (2001)),即分离的Foxp3+Treg细胞明显被CD4+效应和记忆T细胞所污染。此外，目前还没有通过阴性选择获取R)xp3+Treg细胞的方法，即保留无标记/抗体的 i^oxpS+I^reg 细胞。由前述可知，对于用于分离几乎不含⑶4+效应和记忆T细胞的R)xp3+Treg细胞的方法和试剂盒/组合物特别需要。对于不需要阳性选择R)Xp3+Treg细胞的方法也是特别需要的。因此，本专利技术的一个目的是提供避免上本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．从样品中分离人Ｆｏｘｐ３＋调节性Ｔ细胞（Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ细胞）的方法，所述样品含有（ｉ）外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），（ｉｉ）含有淋巴细胞的液体，或者（ｉｉｉ）含有淋巴细胞的组织；所述方法包括步骤：（ａ）用抗ＣＤ４９ｄ抗体以及如下抗体处理所述样品（ｉ）抗ＣＤ２５抗体，或者（ｉｉ）抗ＣＤ１２７抗体；及（ｂ）分离Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ细胞。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：O·伦特兹什科，K·法尔克，M·克莱因维特菲尔德，
申请(专利权)人：分子医学马克斯德尔布吕克中心，
类型：发明
国别省市：DE
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