本发明专利技术提供了一种五种检疫性线虫传多面体病毒(南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、烟草环斑病毒)多重RT-PCR检测用引物及其应用，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1～6所示。本发明专利技术还进一步提供了检测五种检疫性线虫传多面体病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用本发明专利技术特异性引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明专利技术引物特异性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测技术，具体地说涉及五种检疫性线虫传多面体病毒 (Nepovirus)多重RT-PCR检测用引物及其应用。
技术介绍
线虫传多面体病毒属(^povirus)是类小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)中的一个病毒属，包含亚组A、 B和C等3个亚组，至少有34种病毒。线虫传多面体病毒广泛分布于温带地区，有些病毒种类具有非常广泛的自然寄主，对农业安全生产造成重大威胁。12种病毒通过长针线虫(剑线虫属Xiphinema、长针线虫属Longidorus、或拟长针线虫属Paralongidorus spp)持久性传播、3种通过花粉传播，一种通过螨类传播，其他种类还没有发现传播介体。在线虫传多面体病毒中，种子和/或花粉传播非常普遍，已报道21种病毒可以通过种子传播。根据 2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该病毒属中被列为检疫性病毒的种类有南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus, TBRV)、番爺环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV), 共5种。目前，已建立了针对南芥菜花叶病毒、桃丛簇花叶病毒、烟草环斑病毒、番茄黑环病毒、番茄环斑病毒等单个病毒的RT-PCR检测方法，以及同时检测ToRSV和TRSV等2种病毒的多重RT-PCR检测方法(薛杨等，2005 ；吴兴海等，2006)，Digiaro等(2007)建立了亚组 A 的 TRSV、GFLV, ArMV、GDefV 等 4 种病毒的多重 RT-PCR，亚组 B 的 GCMV、AILV、GARSV 和 TBRV等4种病毒的多重RT-PCR，但还未见报道针对我国5种检疫性线虫传多面体病毒的多重RT-PCR检测方法。本申请专利技术人根据5种检疫性线虫传多面体病毒RNAl编码的依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶基因(RNA-cbpendent RNA polymerase gene, RdRp)序列设计 5 条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物，通过反转录(reverse transcription, RT)禾口聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)建立了 ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV、TRSV 的多重 RT-PCR 检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本专利技术所建立的多重RT-PCR方法可以同时检测5种检疫性线虫传多面体病毒，极大提高检测效率，降低检测成本，满足多目标检测要求。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV和TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR检测的引物序列及其应用。本专利技术通过分析已报道的ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV和TRSV等5种检疫性线虫传多面体病毒RNAl上的RdRp基因序列设计5条特异性引物，并在其下游区域的保守区域设计一条可用于5种检疫性线虫传多面体病毒的简并引物。所述的引物对由5条正向引物和1条反向引物组成，其5条正向引物序列为ArMV-342 如SEQ ID NO 1所示，即为5，-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3，、PRMV-293 如 SEQ ID NO 2 所示，即为 5，-CGC CGC TCTATT TGT GGT-3，、TBRV-256 如 SEQ ID NO 3 所示，即为 5，-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3，、 ToRSV-472 如 SEQ ID NO 4 所示，即为 5，-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G_3，、TRSV-695 如SEQ ID NO :5所示，即为5，-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3，；1条反向引物序列为 N印-2IR 如 SEQ ID NO 1 所示，即为 5，-YTT RTC MBT VCC ATC MGT AAT-3，，其中，Y = C/ T, V = G/A/C, R = A/G, B = G/T/C, M = A/C。本专利技术还进一步给出了应用上述引物的多重RT-PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行多重RT-PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的DNA片段判定结果。较佳地，RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42°C，PCR扩增的退火温度为 52°C，延伸温度为72°C。其中，ArMV扩增的 DNA 片段大小为 342bp、PRMV 为 ^!3bp、TBRV 为 25^3ρ JoRSV 为 472bp 和 TRSV 为 695bp。具体地说本专利技术以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。首先在25μ L反应体系进行反转录反应，即在0.6mL的反应管中加入4. OyL RNA, 2μ L Nep-21R(10ymol/L),5. OyL DEPC 处理水，70°C 水浴 5min，立即冰浴 5min 后，加入 5 μ L 5 XM-MLV buffer, 1 μ L M-MLV Reverse Transcriptase, 1 μ L dNTP (各 lOmmol/L)， 0. 5μ L Ribolock RNase Inhibitor，补充 DEPC 处理水至 25 μ L，轻轻混勻后 42°C水浴 lh， 70°C灭活lOmin，合成第一链cDNA，_20°C保存备用。PCR反应体系为25 μ L，即在0. 2mL的PCR反应管中加入2. 0 μ LcDNA, 1. 0 μ L上游引物(10 μ mol/L)，1· 0 μ L 下游引物(10 μ mol/L)，0· 2 μ L DreamTaq DNA Polymerase, 2· 5 μ L 10ΧDreamTaq PCR buffer, 0. 5 μ L dNTP Mixture (各 lOmmol/L), 17. 80 μ L 灭菌水。反应条件如下95°C 3min ；94°C 45s, 52°C 45s, 72°C lmin，；35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin。取5 μ L的PCR产物采用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳电泳检测。进一步，还可以将本专利技术引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。所述的引物在五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测中的应用不限于以上所述， 例如可以加入其它辅助手段进行联合检测。本专利技术根据五种检疫性线虫传多面体病毒RNAl上RdRp基因序列设计引物，该组引物可用于ArMV、PRMV, TBRV, ToRSV、TRSV等五种检疫性线虫传多面体病毒多重RT-PCR 检测。本专利技术检测方法能够快速准确地判断样品是否有检疫性线虫传多面体病毒(ArMV本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．五种检疫性线虫传多面体病毒多重检测用引物，其核苷酸序列为：ＡｒＭＶ－３４２：５’－ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＣ－３’ＰＲＭＶ－２９３：５’－ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＣＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＧＧＴ－３’ＴＢＲＶ－２５６：５’－ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＣＣ ＣＴＣ ＴＧＧ Ａ－３’ＴｏＲＳＶ－４７２：５’－ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＣＡ ＴＴＴ ＡＴＣ ＡＧＣ Ｇ－３’ＴＲＳＶ－６９５：５’－ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＧＴ－３’Ｎｅｐ－２１Ｒ：５’－ＹＴＴ ＲＴＣ ＭＢＴ ＶＣＣ ＡＴＣ ＭＧＴＡ ＡＴ－３’其中，Ｙ＝Ｃ／Ｔ，Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ，Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ，Ｍ＝Ａ／Ｃ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖富荣，郭木金，沈建国，林石明，陈红运，陈青，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：92
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。