一种分离胰岛素单体和多聚体的方法技术

本发明专利技术运用梯度电泳分离胰岛素单体和多聚体，其中在胰岛素样品溶液中加入了稳定剂锌和苯酚，使胰岛素、锌和苯酚三者摩尔比为1:（21000～22000）:（140～160）。本实验成功地建立了分离胰岛素单体与多聚体梯度电泳检测分析方法，为进一步研究胰岛素与糖尿病及阿尔茨海默症的关系奠定了实验基础，同时为除胰岛素以外的其它蛋白质多聚体的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、阿尔茨海默症等蛋白质错误折叠疾病的诊断与防治找出新的药物干预手段等提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于仪器分析领域。
技术介绍
由于胰岛素具有自我缔合的特性。在不同的PH、温度、离子强度等条件下，它能以单体、 二聚体、四聚体、六聚体或更高的聚集态存在。胰岛素是一种变构蛋白，去锌胰岛素在很大的浓度范围内以二聚体和四聚体的形式存在，较难以单体或六聚体存在。含两个Zn2+的胰岛素在很大的浓度范围内以二聚体和六聚体的形式存在，其所含的锌离子对六聚体复合物的稳定性和动力学性质影响很大。在大多数溶液或胰岛素制剂中，胰岛素主要以六聚体形式存在，只有在浓度极稀(约10_9mol ·Ι^)，小于临界聚集浓度的生理条件下，胰岛素才完全解聚以单体活性形式存在。在中性pH7.0时，两个邻近的胰岛素单体的B-M和B-沈之间通过氢键形成二聚体，三个二聚体能聚集成六聚体，锌离子可加速六聚体形成，此时单体的含量小于0. 1%。因其不同聚集态的分子量的不同，利用电泳技术可将其分离成分子量大小不同的条带。但常规电泳的分离分子量范围有限，很难分离出胰岛素这类小分子蛋白的单体。与普通凝胶电泳相比，梯度凝胶电泳的优点在于蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通透，这样蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区带中。利用这一很窄的区带，可以分辨出小分子量及分子量相差较小的蛋白质(胰岛素的分子量约为 6KD)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分离胰岛素单体和多聚体的实验方法。本专利技术的分离胰岛素单体和多聚体的方法，包括下列步骤(1)配置磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris-HCl溶液和NaCl溶液，浓度均为 100-500mmol/L, pH 均为 4-8 ；(2)称取4份一定量的胰岛素，分别溶于一定体积步骤(1)得到的四种溶液中，制成胰岛素含量为0. 5-2mg/ml的4种样品，使其充分溶解，分装保存；(3)步骤(2)所得的四种胰岛素溶液中加入一定量的锌和苯酚作为稳定剂，使胰岛素、 锌和苯酚三者摩尔比为1: (21000 22000) (140 160)。(4)微量注射针上样，进行梯度凝胶电泳，恒压100 200v电泳30min 120min。为了进一步鉴定所分离开的胰岛素单体和多聚体，还要包括如下步骤(5)配制考马斯亮蓝或银染显色的各种试剂，进行凝胶染色；(6)凝胶成像系统照相。步骤(2)中，对4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。步骤(3)中，稳定剂锌和苯酚的配制条件为分别用去离子水溶解一定量的易溶于水的分析纯锌盐和苯酚，最后定容，使得加入胰岛素溶液前，锌离子的浓度范围为 0. 25 7. 5g/ml，苯酚的浓度范围为1 5mg/ml。梯度电泳使用质量体积浓度1 20%的聚丙烯酰胺梯度凝胶，冷却电泳槽至10°C以下，并预电泳25min 45min。本专利技术以胰岛素为实验对象，分离和鉴定其单体、二聚体、六聚体等各种存在形式，其有益效果在于(1)为进一步研究胰岛素与糖尿病及阿尔茨海默症的关系奠定了实验基础；(2)探讨了磷酸根离子对胰岛素单体或多聚体存在形式的影响；(3)为除胰岛素以外的其它蛋白质多聚体的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、 阿尔茨海默症等蛋白质错误折叠疾病的诊断与防治找出新的药物干预手段等提供了新的思路；(4)原材料来源广泛，价格低廉，而梯度凝胶虽然价格较贵，但一次可上10个样，对总体价格影响不太大，实验方法简单易操作。附图说明图1 Bis-Tris梯度胶电泳分离Img · πιΓ1胰岛素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介质中的胰岛素单体和多聚体电泳图谱(采用考马斯亮蓝染色法)。图2 Bis-Tris梯度胶电泳分离Img · πιΓ1胰岛素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介质中的胰岛素单体和多聚体电泳图谱(采用银染染色法)。具体实施方法下面通过实施例进一步描述本专利技术，但本专利技术不局限于下述实施例。实施例1 1.试剂和仪器商品化的胰岛素，4%_20%的NuPAGE Novex Bis-Tris预制凝胶，SeeBlue Plus2预染标准蛋白(IX)(蛋白Marker)，NuPAGE十二烷基硫酸锂样品溶液GX) (LDS)，十二烷基硫酸钠(SDS)，三羟甲基氨基甲烷(1Tris-base )，2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，乙二酰四乙酸 (EDTA)，考马斯亮蓝 R-250, NaH2PO4 · 2H20, Na2HPO4 · 12H20, NaCl，KH2PO4, HCl，NaOH 等均为国产分析纯。微型梯度电泳槽、摇床、PH计、电泳仪、微型漩涡混合仪、电子分析天平、凝胶成像系统。2.溶液的配制 (1) IOOmmol/L 的 PBA 液为 100mmol/L 的 NaH2PO4 · 2H20 称取 1. 5600 g NaH2PO4 · 2H20，加去离子水定容至 IOOml ；B 液为 IOOmmol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 称取 2. 2460 g Na2HPO4 · 12H20，加去离子水定容至 100ml。将19ml的A液与81ml的B液混合后即成IOOmmol/L PB0(2) 100mmol/L 的 PBS称取 8. OOOOgNaCl，0. 2000gKCl, 1. 4400g Na2HPO4 和 0. 2400gKH2P04,加去离子水定容至 100ml。(3) 1 OOmmo 1/L 的 Tris-HCl① IOOmmol/L 的 Tris base 称取 1. 2100g Tris base 用去离子水定容至 100ml。②100mmol/L的HCl (IOOml)用移液管吸取0. 85ml浓HC1，加去离子水定容至 100ml。将IOOmmol/L HCl缓慢加入到IOOmmol/L Tris base中，边加边调PH值至7. 4，即为 100mmol/L 的 Tris-HCl。(4) IOOmmol/L 的 NaCl 溶液称取分析纯NaCl 0. 6000g,用去离子水定容至100ml，其摩尔浓度为100mmol/L。(1) (2) (4)均用 10mmol/L 的此1、100讓01/1妝0!1，使用？!1计调节？!1值至7.4。(5) 20XNuPAGE SDS 电泳缓冲液的配制(贮备液)称取 9. 7600g MES, 6. 0600g Tris base, 1. OOOOg SDS，0.3000g EDTA，加超纯水定容至 50ml (电泳前加950ml超纯水即成1 X NuPAGE SDS电泳缓冲液)。(6)考马斯亮蓝染色试剂①固定液(200ml)甲醇100ml，乙酸20ml，加去离子水定容至200ml。②考马斯亮蓝染色液(200ml):甲醇100ml，考马斯亮蓝R-250 0. lOOOg，乙酸 20ml，加去离子水定容至200ml，在加乙酸和超纯水之前将R-250溶于甲醇。③脱色液(500ml)乙酸35ml，甲醇25ml，加去离子水定容至500ml。3.胰岛素样品溶液的制备称取4份0. OOlOg的胰岛素，分别溶于Iml上述四种溶液中，制成胰岛素含量为Img/ ml的4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解，然后四种胰岛素溶液中各加本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离胰岛素单体和多聚体的方法，包括下列步骤：（１）配置磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液和ＮａＣｌ溶液，浓度均为１００—５００ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ均为　４—８；（２）称取４份一定量的胰岛素，分别溶于一定体积步骤（１）得到的四种溶液中，制成胰岛素含量为０．５—２ｍｇ／ｍｌ的４种样品，分装保存；（３）步骤（２）所得的四种胰岛素溶液中加入一定量的锌和苯酚作为稳定剂，使胰岛素、锌和苯酚三者摩尔比为１：（２１０００～２２０００）：（１４０～１６０）；（４）微量注射针上样，进行梯度凝胶电泳，恒压１００～２００ｖ电泳３５ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田卫群，胡巧琳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83