本发明专利技术公开了一种(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用；其中：能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝缩的(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼的浓度是40～80mg/L。本发明专利技术为制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物和治疗心血管疾病又提供了一条开发和应用的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及吡唑酰腙衍生物在抑制血管内皮细胞衰老和凋亡中的应用；尤其涉及 (E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用。
技术介绍
(E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼结构式如下分子式=C24H2tlClN5O3分子量461.90性状黄色固体。目前，有关吡唑酰腙衍生物鲜有报道，尤其未见(E)-N_(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在血管内皮细胞衰老及凋亡方面的作用以及相关的药理学的研究与应用的报道。针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用。本专利技术所述的(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用；其中 能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝缩的(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的浓度是40 80mg/L。本专利技术的(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在抑制血管内皮细胞衰老和凋亡中具有明显作用，为新型心血管药物的开发提供了诱人前景。为了更好地理解本专利技术的实质及本专利技术所述化合物的作用效果，下面结合
技术实现思路
(E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的药理实验及结果，来进一步阐述其在抑制血管内皮细胞衰老和凋亡中的作用。血管内皮细胞的制备以常规方法培养血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞，备用。观察(E)-N_(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼对抑制去除血清和生长因子的血管内皮细胞衰老和凋亡的影响。1、显微镜观察细胞形态学变化将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，分别加(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1- (3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼，处理M小时和48小时。然后，光镜下直接观察血管内皮细胞凋亡的形态学变化和凋亡小体的形成。结果发现(E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1- (3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理血管内皮细胞M和48小时，较之对照组可明显抑制凋亡小体的形成以及凋亡的形态学变化(见图1)。2、荧光显微镜观察细胞核凝缩及核碎裂情况将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组细胞。正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和生长因子培养；处理组是将血管内皮细胞去除血清和生长因子后，加(E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理M小时。 然后对各组进行AO染色，在荧光显微镜下观察血管内皮细胞凋亡时，细胞核DNA的凝缩及核碎裂情况。结果显示处理组中细胞核DNA凝缩及碎裂较对照组减少(见图2)。3、用MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性，以判断血管内皮细胞生长情况将血管内皮细胞接种于96孔培养板中，经不同浓度(40，60，80 μ g/ml) (E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理后，在M小时和48小时分别用MTT法测琥珀酸脱氢酶活性，计算存活率，存活细胞％ =(处理组OD值/对照组OD值)X 100% (以不含细胞的培养液为空白组调零)。结果表明处理组细胞存活率较对照组显著升高且呈剂量依赖性。(E) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼对细胞生长的影响结果见下表药物(|J g/ml) M小时细胞存活率(％)48小时细胞存活率(％)对照组 54. 7±3. 1046. 89±5. 46DMSO 组 54. 60 土 3. 5045. 16 土 5. 26 药物处理组40 66. 79±4. 7352. 12±3. 22 60 72. 46±5. 5263. 32±6. 43 _80_75. 72±4. 14 _ 65. 71±2. 57_4、Tunel染色标记凋亡细胞将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组細胞。正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和 生长因子培养；处理组是将血管内皮細胞去除血清和生长因子后，加 )-N-(2-羟基苯亚 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理M小吋。 然后，用福尔马林固定25分钟，0.2% Triton X-100处理5分钟，每孔加入50 yl rTdr孵 育液，37°C下孵育1小吋，SSC终止反应，检测标记凋亡細胞。分别计数正常组細胞、对照组 細胞、处理组細胞，计算其阳性率。结果显示(见图3):正常组細胞，用含有血清和生长因子的M199培养液培养M小时几乎无阳性细 胞；对照组細胞，去除血清和生长因子M小吋，阳性细胞较多；处理组細胞，用￠) -N- (2-羟基苯亚甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧 基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理M小吋，阳性细胞较对照组显著降低。提示⑶-N_(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯 基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可抑制血管内皮細胞凋亡。5、衰老相关的0 -半乳糖苷酶染色，以判断细胞衰老情况将所培养的细胞分为正常组细胞、对照组细胞和处理组細胞。正常组细胞用含有血清和生长因子的M199培养液培养；对照组细胞去处血清和 生长因子培养；处理组是将血管内皮細胞去除血清和生长因子后，加 )-N-(2-羟基苯亚 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理M小吋。 然后，用￠-半乳糖染液染色后观察。随机选取正常组细胞、对照组细胞和处理组細胞中的 各10个视野，计数细胞总数和阳性細胞数，计算阳性率。结果显示(见图4):正常组細胞，含有血清和生长因子的M199培养液培养M小吋，阳性率较低；对照组細胞，去处血清和生长因子阳性率较正常細胞组阳性率上升；处理组細胞，去处血清和生长因子用-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡 啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼处理M小吋，阳性率下降。提示⑶-N_(2-羟基苯亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．（Ｅ）－Ｎ－（２－羟基苯亚甲基）－１－（３－（６－氯吡啶）甲基）－３－（４－甲氧基苯基）－１Ｈ－吡唑－５－碳酰肼在制备抑制血管内皮细胞衰老和凋亡药物中的应用。
【技术特征摘要】
1. (E)-N-(2-羟基苯亚甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -...
【专利技术属性】
技术研发人员：张尚立，张恒，常宏文，马剑峰，王丽，王萍，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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