本发明专利技术涉及一种多糖的制备工艺及应用，尤其涉及一种高生物利用度、低分子量改性果胶(MPHB)的制备工艺及其在抗肿瘤领域中的应用。所公开工艺包括如下步骤：将果胶与水混合，加热，溶胀；冷却，用碳酸盐溶液调节pH，以果胶酯酶(EC?3.1.1.11)降低酯化度，提高温度灭活酶；冷却，以聚半乳糖醛酸酶(EC?3.2.1.15)或果胶裂解酶(EC?4.2.2.10)降解果胶主链，产物经膜过滤、脱盐、浓缩与干燥获得MPHB。本发明专利技术所述工艺利于规模化制备MPHB，利于控制其分子量与分子量分布。MPHB具有抗肝癌、宫颈癌等活性，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，利于进一步提高生物利用度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多糖的制备工艺及应用，尤其涉及一种高生物利用度改性果胶的制备工艺及其在抗肿瘤领域的应用。
技术介绍
提高生物活性、降低毒性、提高生物利用度是开发新药，获得成功的重要方法。提高生物利用度，对于高分子药物意义尤其重大。果胶(pectin)是一种主要来源于植物的多糖，产生于较为高等的植物初级细胞壁和细胞间质内，它是一个异型分支(heterogeneous branched)的杂多糖家族。几乎所有的植物中都含有果胶，柑橘、苹果等水果含量尤为丰富。果胶被世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)等机构确定为食品原料，证实了其安全性。以果胶为原料制备抗肿瘤药物或功能食品，是其区别于具有较高毒性的化疗药物的优势之一。某些多糖其生物活性与其高级结构有关；某些多糖其生物活性仅与其线性结构有关。对于后者，分离其活性片断、简化其分子(例如通过降解多糖获得低分子多糖)，有利于富集其“药效基团(pharmacophore) ”，提高多糖的“类药性(druglikeness) ”和生物活性。 果胶一词描述的是这样一组多糖其分子中存在大量部分甲酯化的半乳糖醛酸和少量鼠李糖。果胶结构由两部分组成长长连续的、“平滑的”同聚半乳糖醛酸(homogalacturonan， 缩写作HG)骨架，以及短短的、“毛发状的”(hairy region or ramified region)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖支链。α -(1 — 4)糖苷键连接的D-半乳糖醛酸单元被(1 — 2)糖苷键连接的鼠李糖残基插入，形成鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan，缩写作RG)。4)- α -D-GalpA-(1，2)- α -L-Rhap-(1，果胶毛发区分为RG-I和RG-II两类。连接有半乳糖、木糖和阿拉伯糖等中性糖侧链的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，称为RG-I。RG-II含有非常复杂的中性糖支链，例如芹菜糖 (apiose)、2-酮-3-脱氧辛糖酸 Q-keto-3-deoxy-octanoic acid, KD0)，但半乳糖残基含量不显著。天然多糖往往生物活性缺失或很低，但经过改性可提高其生物活性。多糖常作为生物应答调节剂(biological response modifier, BRM)起作用，而作为BRM首先要求生物体能够吸收它，即具有高生物利用度。对果胶进行改性，提高其生物利用度可提高生物活性便是多糖改性成功的例子。果胶在肿瘤预防、治疗中的应用早有研究。据李时珍《本草纲目》记载“乳癌(乳房内有核如指头，不痛不痒，五、七年成痈，名乳癌)。用青皮四钱，加水一碗半煎成一碗，徐徐服下。一天服一次，或用酒送服亦可。”这里所述的青皮指柑橘皮。用现代的观点推断，存在于柑橘皮中的果胶多糖经过煎煮使得长链被打断变成短链并易于被血液吸收。研究较多的果胶的抗癌活性是其抗结肠癌活性[高林.MCP多糖的制备、分析鉴定及其抗肿瘤作用的研究[D].天津大学硕士学位论文，2005;张文博.改性柑橘果胶的制备、表征及抗癌活性D)].天津大学博士学位论文，2006]。早期的果胶抗肿瘤研究通常都是指不溶性果胶，其抗癌机理可能与其作为膳食纤维(dietary fiber)的功能有关。对果胶改性以提高其抗肿瘤活性并扩大其“抗癌谱”，其一需要提高其生物利用度，其二需要富集和暴露其“药效基团(pharmacophore) ”。改性柑橘果胶(modified citrus pectin, MCP)是通过水解天然柑橘果胶(CP)而获得的一种分子量更小、酯化度(degree ofmethylation,DM)更低、分支更短的果胶多糖，是果胶改性成功的典范。与CP相比，酸碱降解后的果胶更易被小肠微绒毛吸收，并直接进入血管进而在体内存留。Platt等[Platt D, Raz A. Modulation of the Lung Colonization of B16-FIMelanoma Cells by Citrus Pectin [J], J Natl Cancer Inst. 1992，84 (6) :438-442.]报道，注射 MCP 可明显减少小鼠植入B16-F1黑色素瘤细胞后的肺部集落，而CP则增加其肺部集落。MCP可能通过与肿瘤表面过表达的半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)相互作用而起到抗肿瘤转移等作用。 目前国内外多家研究机构与公司，通过降解柑橘果胶或者其他类型的果胶以获得分子量更低、酯化度更低能够被人体吸收，具有抗肿瘤活性的低分子量改性果胶(Modified Pectin with High Bioavailability, low molecular mass and antitumor activities,本文简禾尔 MPHB)。MCP中末端半乳糖残基可能起到识别Gal-3的作用，从而具有抗肿瘤转移等活性。 酯化度、糖醛酸含量等可能影响MPHB在体内的吸收、转运、降解等过程。MCP具有较低的 DM。果胶在较高DM(超过30% )时，主要在肠道起作用[Kunz etal. Method for producing pectin hydrolysis products[P],美国专利:7960351,2010-06-14.]；较低DM则能不仅增强果胶的水化度，而且可能还会使MCP易于接近体内靶点。虽然果胶HG与毛发区对于免疫增强活性或凋亡诱导活性可能有贡献，但尚无确切结论，而且果胶高级结构与抗肿瘤活性之间的关系尚无系统研究。张文博等[张文博等.改性柑橘果胶的制备、表征及抗癌活性[J]·高等学校化学学报，2010，31 (5) :964 969.]制备的MCP其骨架结构主要为HG和 RG-I，并含有末端半乳糖，据作者推测，与RG-I相连的分支结构可能是该多糖抗肿瘤活性的关键位点。果胶既可以通过酸碱处理(化学法)、也可以通过酶法处理(生物法)获得适宜的酯化度(degree of methylation，DM)、适宜分子量的低分子量改性果胶。碱皂化反应， 降解半乳糖醛酸甲酯键，在降低酯化度的同时，发生消除反应，能降低果胶分子量。果胶进一步经过高温酸解，分子量继续降低。皂化与酸解过程发生一种脱皮效应(peeling effect)，导致果胶毛发区部分或完全被降解，中性糖含量降低。事实上，HG的糖苷键受到羧酸根的影响，在酸处理下的稳定性远远大于中性糖组成侧链对酸的稳定性。果胶，尤其是酯化度高的果胶，几乎完全不能溶解于水，生物利用度几乎为零。将果胶与水混合，其状态与普通淀粉和水混合的状态一致，即团块表面已经逐步水化、溶胀，而团块中心可能仍然干燥。采用规模较大的容器对果胶进行降解之初期，有些团块完全悬浮于溶液主体表面；有些团块粘附于容器壁；有些团块沉淀在容器底部。即便搅拌速度很快，这些团块表面发生皂化后，仍然有很多果胶尚未发生反应。但是，由于皂化反应、脱皮效应、β -消除反应等过程几乎同时进行，导致部分果胶片段分子量过小，成为分子量小于2000道尔顿(简称Da) 的果胶寡糖或皂化完全的果胶酸(pectic acid)；部分果胶尚未充分反应，成为溶解度差、 难以吸收的胶状果胶。这种酸碱降解的工艺，在产能放大时，导致分子量分布严本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备具有抗肿瘤活性高生物利用度改性果胶（以下简称ＭＰＨＢ）的新工艺，其特征在于包括如下步骤：（１）在１份果胶中加入１０～１０００份水，混合，加热至６０～９５℃，溶胀３～１２小时；（２）冷却至４５～５５℃，在同一容器内用碳酸盐溶液调节ｐＨ至４．５～８．５之间，加入果胶酯酶（ＥＣ ３．１．１．１１），搅拌均匀。待容器内果胶酯化度降低到０．４％至１０％范围内，提高温度至８０～９０℃，保持３０－９０分钟；（３）上述溶液冷却至４０～５５℃，向同一容器内加入聚半乳糖醛酸酶（ＥＣ３．２．１．１５）、果胶裂解酶（ＥＣ ４．２．２．１０）和鼠李糖半乳糖醛酸酶（ＥＣ ３．２．１．Ｘ）中的任意一种，产物经膜过滤、脱盐、浓缩与于燥获得改性果胶ＭＰＨＢ。
【技术特征摘要】
1.一种制备具有抗肿瘤活性高生物利用度改性果胶(以下简称MPHB)的新工艺，其特征在于包括如下步骤(1)在1份果胶中加入10 1000份水，混合，加热至60 95°C，溶胀3 12小时；(2)冷却至45 55°C，在同一容器内用碳酸盐溶液调节pH至4. 5 8. 5 之间，加入果胶酯酶(EC 3. 1. 1. 11)，搅拌均勻。待容器内果胶酯化度降低到0.4%至10% 范围内，提高温度至80 90°C，保持30-90分钟；( 上述溶液冷却至40 55°C，向同一容器内加入聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 15)、果胶裂解酶(EC 4. 2. 2. 10)和鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2. 1.X)中的任意一种，产物经膜过滤、脱盐、浓缩与于燥获得改性果胶MPHB。2.权利要求1所述的膜过滤，其特征在于所述的膜为超滤膜，采用错流过滤模式，首先以截流分子量在^OOOODa到70000Da之...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文博，徐萍，高林，闫清华，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：41
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