本发明专利技术涉及一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用，其微生物保藏号是：CCTCC?V201113；分类命名：新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是：2011年5月9日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学，具有以下优点：1、已经充分适应BHK21细胞，其增殖滴度可达108.0TCID50/ml；2、具有较好的耐热特性，56度处理1小时HA效价无明显下降；3、具有弱毒特性，鸡胚平均致死时间大于90小时，脑内致病指数为0.00；4、以该毒株制备的新城疫耐热活疫苗(传代细胞源)具有耐热、保存期长、保护力好、可避免生产用鸡胚携带异源病毒等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物病毒领域，涉及一种病毒新毒株，具体涉及一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株及其制备方法和应用，其微生物保藏号是CCTCC V201113 ；分类命名新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是2011年5月9日；保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国.武汉.武汉大学。
技术介绍
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)为副粘病毒科腮腺炎病毒属成员， 是有囊膜的负链RNA病毒。由NDV引起的新城疫(Newcastle disease, ND)是一种极易传染的毁灭性疾病，死亡率可达90%以上，被国际兽疫局认定为两种A类禽病之一(另一种为禽流感)。ND的防控以免疫预防为主。当前国际上生产和使用的ND疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗，活疫苗又包括低毒力和中等毒力活疫苗。中等毒力活疫苗免疫效果优良，抗体一致性好，但对雏鸡、鸽和鹌鹑等有较强的毒副反应，此类疫苗免疫的禽肉不符合出口要求；灭活疫苗使用安全、免疫效果好，但需要肌肉注射，费工费时，免疫成本高，且影响禽肉品质，使其应用受到了一定的限制；低毒力活疫苗以其使用方便(可通过拌料、饮水、喷雾、 滴鼻、点眼或注射等多种方式给苗)和毒副作用较小等优点在我国应用最为广泛。但低毒力活疫苗耐热性能较差和冷藏条件要求高，常因保存或使用不当而影响疫苗免疫效果，不利于在我国气温普遍较高的南方地区和冷藏条件较差的农村进行大面积推广应用。因此， ND低毒力耐热活疫苗在我国有着较为广阔的应用前景。当前，包括耐热活疫苗在内的ND疫苗生产主要是使用鸡胚，而以普通鸡胚生产疫苗就可能使疫苗在生产过程中污染一些可由鸡胚垂直传播的疫病病原，导致这些病原随着疫苗的使用而广泛传播。使用异源传代细胞制备ND疫苗可避免鸡胚传播其他疫病的风险。 关于NDV毒株在各种细胞中的增殖研究国内外均有报道。研究表明NDV可在鸡胚尿囊液中复制并产生感染性的病毒粒子，NDV强毒株可在多种体外培养细胞中复制，但是弱毒株只能在含有胰蛋白酶的细胞中进行复制。但迄今为止，仍未见适应传代细胞的NDV耐热弱毒株的研究报道。现有关于新城疫病毒株的技术文献，主要有以下几项如专利申请号为 CN200710003046. 9的文献“新城疫病毒D90毒株及其应用”公开了新城疫病毒D90毒株，还公开了该毒株在抗肿瘤中的应用，但D90毒株不具备适应传代细胞和耐热的特性；专利申请号为CN200610001693. 1的文献“表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota 弱毒疫苗株”和专利申请号为CN200610075781. 6的文献“表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株”公开了两种能够表达外源病毒基因的新城疫病毒 Lasota株，同样这两种毒株也不具备适应传代细胞和耐热的特性
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的、适应传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株。本专利技术还有一个目的是提供所述的弱毒株应用于制备预防新城疫的耐热活疫苗 (传代细胞源)，所述的耐热活疫苗具有耐热、保存期长、保护力好和可避免生产用鸡胚携带异源病毒等优点。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案一株适应幼仓鼠肾传代细胞 (BHK21)的新城疫病毒(NDV)耐热弱毒株，其微生物保藏号是CCTCC V201113 ；分类命名 新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是2011年5月9日；保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国.武汉.武汉大学。所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法，是在含有 0. 2 μ g/mlTPCK-胰酶的培养条件下，将新城疫病毒TS09鸡胚适应株在BHK21细胞中进行 17次连续传代培养，其中有3次为极限稀释法纯化，传至第17代即获得适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株，即新城疫病毒TS09-C株。按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株在BHK21细胞中的增殖效价达 IO8.0TCID50/ml。按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因序列为 SEQID NO :1ο按上述方案，所述的新城疫病毒耐热弱毒株与原型株TS09株的HN基因序列的核苷酸同源性为88.2%。本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的细胞增殖效价测定病毒细胞培养物离心后，取上清液进行半数细胞感染剂量(TCID5tl)的测定，将上清液进行10 倍梯度稀释，取10_5，IO-6, IO-7和10_8稀释度样品接种长成致密单层的ΒΗΚ21细胞，接种量为0. Iml/孔，每个稀释度接种5孔细胞。观察细胞病变，如120小时内出现细胞病变则判定为阳性，如未出现细胞病变则判定为阴性，以Reed-Muench法计算TCID5Q。结果该毒株的细胞增殖效价为108_°TCID5Q/ml。本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的致细胞病变效应观察 病毒液以10_3稀释后，接种长成致密单层的BHK21细胞，观察细胞病变情况。结果细胞在接种病毒48小时左右，开始出现大小不等、椭圆形的空泡、细胞融合，在72 96小时内，出现大量细胞破碎、死亡、悬浮于营养液中。对本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行RT-PCR扩增及序列测定，发现该弱毒疫苗株的HN基因序列为SEQ ID NO 1，序列总长度为1851bp。对本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的HN基因序列进行分析通过MegAlign程序(DNAstar软件包)进行HN基因序列比对，证实该耐热弱毒株与其原型株TS09株的HN基因核苷酸同源性为88. 2%。本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株可用于制备新城疫耐热活疫苗(传代细胞源)，用于新城疫的预防。本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株制备成疫苗的方法选用生长状态良好、长成致密单层的BHK21细胞，倾弃培养液后，换以含0. 病毒种子液的无血清DMEM营养液(含0.2 μ g/ml TPCK-胰酶)，置于37度培养，每日观察细胞状态。发现生长异常、污染的细胞应废弃。培养2 3日后，约有80%以上的细胞出现病变，且对照细胞状态良好，即可收获，经三次反复冻融后，置-20度保存。取少量进行无菌检验和病毒效价检验。将检验合格的病毒液与保护剂按1 1比例混合，充分摇勻后分装，迅速进行冷冻真空干燥。然后进行物理性状、纯粹、效价、安全和效力等检验。检验合格的产品即为新城疫耐热活疫苗(传代细胞源)。本专利技术适应BHK21细胞的NDV耐热弱毒株与现有的NDV弱毒株相比，具有以下优点·1、已经充分适应BHK21细胞，其增殖滴度可达108_°TCID5(1/ml ；2、具有较好的耐热特性，56度处理1小时HA效价无明显下降；3、具有弱毒特性，鸡胚平均致死时间大于90小时，脑内致病指数为0. 00 ；4、以该毒株制备的新城疫耐热活疫苗(传代细胞源)具有耐热、保存期长、保护力好、可避免生产用鸡胚携带异源病毒等优点，具有广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株感染BHK21细胞后的细胞病变图，(A)感染48小时的BHK21细胞；⑶本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株，其微生物保藏号是：ＣＣＴＣＣＶ２０１１１３；分类命名：新城疫病毒ＴＳ０９－Ｃ株；保藏时间是：２０１１年５月９日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国．武汉．武汉大学。
【技术特征摘要】
1.一株适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株，其微生物保藏号是 CCTCCV201113 ；分类命名新城疫病毒TS09-C株；保藏时间是2011年5月9日；保藏单位 中国典型培养物保藏中心；保藏地址中国.武汉.武汉大学。2.按权利要求1所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法，其特征在于所述的新城疫病毒耐热弱毒株在幼仓鼠肾传代细胞中的增殖效价达 IO8.0TCID50/ml。3.按权利要求1所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法， 其特征在于所述的新城疫病毒耐热弱毒株的血凝素-神经氨酸酶基因序列为SEQ ID NO 1，序列总长度为1851bp。4.按权利要求1所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法， 其特征在于所述的新城疫病毒耐热弱毒株与原型株TS09株的HN基因序列的核苷酸同源性为88. 2%。5.权利要求1所述的适应幼仓鼠肾传代细胞的新城疫病毒耐热弱毒株的制备方法，其特征在于在含有0. 2 μ g/ml TPC...
【专利技术属性】
技术研发人员：温国元，邵华斌，杨峻，商雨，王红琳，罗青平，张蓉蓉，郭静，艾地云，罗玲，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：83
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