一种万能供肝的制备方法技术

本发明专利技术属于临床医学研究领域，具体涉及一种万能供肝的制备方法，包括：对A型肝脏采用保存液Ⅰ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对B型肝脏采用保存液Ⅱ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对AB型肝脏同时采用保存液Ⅰ和保存液Ⅱ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上，其中：所述的保存液Ⅰ由3000mlHTK液加入60mgα-N-乙酰基半乳糖苷酶制成，所述的保存液Ⅱ由3000mlHTK液加入5mgα-半乳糖苷酶制成，得到血型抗原为O型的万能供肝。本发明专利技术有效解决了ABO血型不相容的肝脏移植等问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床医学研究领域，具体涉及一种血型抗原为A型、B型、或AB型肝脏转变为0型万能供肝的制备方法。
技术介绍
据世界卫生组织报告，目前全世界约有3. 5亿人为乙肝肝炎病毒携带者，每年约有4500万人死于肝硬化，6000万人死于原发性肝癌。其中3000万为慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌，每年死于慢性肝病的就高达30万人。而盛行的酒文化和超负荷工作，催化剂般促进肝炎快速进展为爆发性肝功能衰竭或肝硬化、肝癌。肝脏移植已成为公认的治疗终末期肝病的最有效治疗方法，因此近几年活体肝脏移植在国内几大肝脏移植中心获得了快速发展。活体肝脏移植的供体主要为配偶和兄弟姐妹，相对限制在有限的几位直系亲属，供受体之间ABO血型不相容就会经常出现。而在紧急或供肝紧缺的情况下，需进行供受体ABO血型不相容的肝脏移植，但其移植肝总5年生存率低于20%，而血型相符或相容的移植肝总5年生存率为68% (根据2006年UNOS数据库统计)。而围手术期死亡率在15% — 45%之间，死因多为感染、超急性排斥反应、原发性肝脏无功能和肝动脉栓塞等，进而导致再次肝移植率高达36%。因此安全实施供受体ABO血型不相容的肝脏移植已成为全球肝脏移植专家的最关注问题之一。人类ABO血型抗原在肝脏主要表达于肝动脉、门静脉、胆管上皮以及肝窦内皮细胞。当血型不合的供肝植入患者体内后，受体体内作为天然抗体的A、B凝集素，可直接与移植物血管内皮细胞、胆管上皮细胞上的抗原结合而形成抗原抗体复合物，引起一系列抗体介导的排斥反应，激活补体系统，迅速破坏移植物内的血管网，引起广泛血栓，导致移植物失去功能。同时，若受体的抗A、抗B、或抗AB抗体效价过高，则可以出现超急性体液免疫反应的排斥损伤；移植物中的A、B抗原还可刺激受体引起溶血性贫血和血小板减少。因此供受体之间ABO血型相容或相符是实施肝脏移植的一个基本条件。一系列措施已经被发展起来用于改善ABO血型不相容的肝脏移植术后的效果，如发展起来的术中加行脾脏切除，经门静脉、肝动脉灌注前列腺素El和激素，血浆置换、特异性免疫吸附抗体，抗⑶-20单克隆抗体美罗华(anti-⑶20，rituximab)应用，使的ABO血型不相容的肝脏移植效果有了明显的改善，但仍普遍低于血型相合组，其移植肝总5年生存率低于20%，而血型相符或相容的移植肝总5年生存率为68% (根据最新UNOS数据库统计)。而围手术期死亡率在15% — 45%之间，死因多为感染、超急性排斥反应、原发性肝脏无功能和肝动脉栓塞等，进而导致再次肝移植率高达36% ^日本京都大学移植中心是目前全世界最成功开展供受体间ABO血型不相容的肝脏移植，取得术后移植肝5年生存率为65%的可喜成果，但是与其移植中心ABO血型相符或相容的肝脏移植术后的5年生存率 (76.9%)2仍有一定的差距。而应用抗⑶-20单克隆抗体美罗华所引起的肺水肿、低氧血症和心肌梗塞等并发症，肝动脉插管引起的术后肝动脉大出血，门静脉插管引起的门静脉血栓，血浆置换须要大量的血浆和血液传播疾病的风险使的血型不相容的肝脏移植术后并发症明显增多，相应医疗费用明显增加。我科600百多例肝脏移植中，供受体ABO血型不相容的肝脏移植为8例，围手术期死亡率为50% 3。因此改善供受体ABO血型不相容的肝脏移植疗效是移植外科医师的关注热点。那如何解决临床肝脏移植实际中经常面对的ABO血型不相容难题呢？如果能把供肝血管内皮细胞、肝窦内皮细胞和胆管上皮细胞上的ABO血型抗原去除，成为0型供肝， 也就是所谓的“万能供肝”，就将ABO血型不相容的肝脏移植转化为ABO血型相容的肝脏移植，满足了肝脏作为移植免疫特惠器官要求的只要ABO血型相容的原则。ABO血型抗原的差异性是由红细胞膜表面的糖蛋白和糖脂上的寡糖链所决定的， 而构成这些寡糖链的是少数暴露于红细胞表面的糖基。因此，是糖基的构成种类和顺序决定了红细胞表面是抗原A或者抗原B。0型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖；B型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一半乳糖；A型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺；AB型血糖分子结构链为A型、B型两种结构兼有。从这可以看出，其他血型与0型血的区别就在于多出了些“枝杈”如果剪掉这些“枝杈”所有的血就都就成0型血了。上世纪70到80年代，研究人员已经发现从梭菌中提取的α -半乳糖苷酶、α -岩藻糖苷酶和α -半乳糖胺酶可以分别破坏红细胞的A、Β、Η抗原。之后逐渐证实了绿色咖啡豆中制备的α-半乳糖苷酶可以将B型血转变为0型血，而同时，α - N -乙酰半乳糖胺酶则可以作为A型血向0型血转变的工具酶。但是，咖啡豆中的半乳糖酶却少得可怜，从50磅的咖啡豆中提取的酶，只能完成200毫升B型血变0型血的转化4’5。2007年生物技术的进展使的此设想成为可能。美国哈佛大学和丹麦哥本哈根大学科学家组成的国际研究小组从2500种细菌当中，发现两种特殊细菌Elizabethkingia meningosepticum (脑膜脓毒性菌)和Bacteroides fragilis (脆弱类杆菌)，并提取了特殊的酶(a-Ν —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶)。它们具有高效性和高选择性地将 A型和B型血中的抗原从血红细胞上移除的能力。这项技术已经在标准实验室中得到了验证。将这种细菌蛋白酶60mg置入200毫升的A型、B型或AB型血中，把真菌中的细菌酶当作“剪刀”，将A型、B型和AB型血中的抗原剪掉，1小时后，A、B抗原就完全消失了，这3种血型的血全部转变成0型血，同时保持了红细胞的完整性和功能，整个过程不影响红细胞的生理和代谢参数6。a_N —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶在中性缓冲盐液内发挥高效酶解作用，如分别转化200毫升洗涤A1、A2红细胞分别只需要60毫克、5毫克酶；而酶本身是低消耗，转化每毫升洗涤红细胞60分钟只需300微克酶，同时，抗原转化过程与酶的剂量和时间是成线性关系。重要的是此酶在转化结束后可以用等张PBS缓冲液简单冲洗就可除去6。器官保存研究的进展显示常温下机械持续灌注保存在动物模型已经被证明为优于常规低温保存6夂。肝脏常用保存液之一 HTK (histidine-tryptophanketoglutarate) 液是细胞外液，PH值近中性(7. 2)，渗透压310，在0°C— 4°C可以保存18 —对小时，在 37°C可以保存4小时f^ 12。主要成分是缓冲盐，符合a-Ν —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶酶解的条件。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的诸如肝脏供体不足、ABO血型不相容的肝脏移植等问题， 本专利技术的目的在于提供，使ABO血型不相容的肝脏移植转化为 ABO血型相容的肝脏。本专利技术的目的是通过以下技术方案得以实施的 ，包括如下步骤(1)检测待移植肝脏的血型抗原类型，(2)对不同血型抗原类型的待移植肝脏做血型抗原转化处理，操作方法如下对A型肝脏采用保存液I在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对 B型肝脏采用保存液II在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对AB型肝脏同时采用保存液I和保存液II在本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种万能供肝的制备方法，包括如下步骤：（１）检测待移植肝脏的血型抗原类型，（２）对不同血型抗原类型的待移植肝脏做血型抗原转化处理，操作方法如下：对Ａ型肝脏采用保存液Ⅰ在１５℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对Ｂ型肝脏采用保存液Ⅱ在１５℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对ＡＢ型肝脏同时采用保存液Ⅰ和保存液Ⅱ在１５℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上，其中：所述的保存液Ⅰ由３０００ｍｌＨＴＫ液加入６０ｍｇ　α－Ｎ－乙酰基半乳糖苷酶制成，所述的保存液Ⅱ由３０００ｍｌＨＴＫ液加入５ｍｇ　α－半乳糖苷酶制成，（３）检测血型抗原转化处理后的肝脏，得到血型抗原为Ｏ型的万能供肝。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨富春，郑树森，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86