本发明专利技术涉及治疗或预防癌症的药物。该药物包含了有效剂量的人转录正辅因子4（PC4）拮抗剂，特别是，所述的PC4拮抗剂为抗PC4的抗体，所述抗PC4的抗体为PC4的亚型特异性抗体，且为结构域抗体。该药物通过抑制PC4的表达水平或功能来达到治疗或预防癌症的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗或预防癌症的方法和药物以及抗癌药物筛选方法。
技术介绍
人转录正辅因子4(PC4，也称pl4、pl5、Subl的同源类似物等)是一种单链DNA结合蛋白，这种蛋白由127个氨基酸残基组成且靠近N-端有数个丝氨酸富集区。PC4已被克隆并鉴定为一种能通过与许多序列特异性和细胞特异性调节子直接作用来介导许多基因的转录活化的通用正辅因子(参见文献Ge等，Cell (1994) 78 :513-523 ；Kretzschmar, Μ.等， Cell (1994) 78 :525-534)。PC4直接作用的这些调节子包括许多核激素受体、肿瘤抑制子、 癌蛋白、以及肿瘤的发生过程和其他人类疾病的病变过程中所必须的重要因子。肿瘤抑制蛋白P53直接与PC4蛋白在转录水平发生相互作用，从而控制了 PC4的表达。另外，PC4作为P53的唯一激活子可以调节许多参与细胞周期、凋亡、DNA修复和其他细胞应答的基因的转录(参见文献Kishore A. H.等，Biochem. J. (2007) BJ20070390 ； Banerjee, S.等，Mol. Cell Biol. (2004)24:2052-2062)。PC4 的活性受到翻译后修饰的进一步调节，该翻译后修饰的类型至少包括磷酸化修饰和乙酰化修饰。PC4被磷酸化修饰之后，其与目标激活因子作用的活性被抑制且能反向介导其辅激活因子的功能。质谱分析结果表明体内的PC4超磷酸化修饰主要由酪蛋白激酶II介导且仅发生在N-端丝氨酸富集区(参见文献 Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) PC4 的乙酰化修饰由P300介导且受到磷酸化修饰的抑制(Kumor, P. B. R.等，J. Biol. Chem. (2001)276 16804-16809)。到目前为止，大家还不清楚PC4在调节基因中所起的作用是否与癌症或肿瘤的发生有关。
技术实现思路
专利技术人采用了包括爪蟾卵母细胞系、人体组织、其他哺乳动物细胞系在内的不同的模式生物体系，惊奇地发现PC4具有癌蛋白的功能且在细胞分化、肿瘤发育和病变的过程中起重要作用，见图10示出的PC4的多种功能，所有这些功能，尤其是图10中标注下划线的功能，都与癌症发病机理相关或者是癌症发病的基础。特别是，专利技术人研究发现在很多恶性肿瘤组织中，如在肺癌组织、膀胱癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、子宫内膜癌组织、 甲状腺癌组织、小肠癌组织中，都发现PC4在蛋白水平被活化。相反，在相应的没有经历过快速生长的正常组织中的PC4的蛋白水平没有升高。在癌细胞系和其他转化细胞系中还发现了 PC4 RNA水平的升高，但是在原代细胞系中并没有发现。例如，专利技术人测定了非洲爪蟾的变态发育过程中的PC4的表达水平。测定方法如下收集不同发育阶段的非洲爪蟾的整体溶解产物，监测每个溶解产物的蛋白含量，选取 50ug每个阶段溶解产物中的总蛋白，上SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，然后将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维膜上，最后进行蛋白印迹分析，即采用抗PC4的多克隆抗体来检测被转到硝酸纤维膜上的蛋白。测定结果如图5A、图5B和图5C所示，PC4的表达水平与非洲爪蟾蜍变态发育过程相关，当前变态发育开始时，PC4在56 58这个阶段被显著活化。专利技术人通过转染检测实验证明PC4与细胞死亡相关。将人PC4编码区(野生型的或丝氨酸富集区突变型的人PC4编码区)与绿色荧光蛋白(GFP)的编码区融合后，再亚克隆到包含有CMV启动子哺乳动物表达载体(pcDNA3. 1)中，再将得到合成载体瞬时转染到 HeLa 细胞(参见 Ge 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 :12691-12695) 转染后 M 小时，在激光共聚焦显微镜下观测样本，能观察到PC4在转染的HeLa细胞中所起的作用。结果如图6A、图6B、图6C所示，图6A是对照组(未转染的HeLa细胞)的荧光检测结果，图6B 是转染了野生型PC4的HeLa细胞的荧光检测结果，图6C是转染了 N-端丝氨酸区突变型卩〇4( 04-八3，其不能被磷酸化，所以应该是完全活化的)的HeLa细胞的荧光检测结果。三幅图对比可以看出，PC4位于细胞核中且能够导致染色体凝集和细胞凋亡，尤其是从图6C 可以判断PC4的过量表达引发了凋亡，这一点与癌蛋白的作用是一致的。另外，专利技术人还采用蛋白印迹分析法测定了许多组织中的PC4水平。收集手术后切除的不同的组织(恶性肿瘤组织的记为“T”，正常组织记为“N”，由美国国立卫生研究院提供)，并快速冷藏到-80°C环境中直至使用。组织裂解液的制备过程如下向组织溶液中加入裂解缓冲液(裂解缓冲液体积为总体积的1/10)后，用微型高速搅拌器将其分散均勻。 离心后收集溶液部分。检测所收集的溶液部分裂解物的蛋白浓度，可以采用Bradfort蛋白检测方法(BioRad蛋白检测仪)。为测定PC4的表达水平，取50ug正常组织或恶性组织的组织裂解物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维素膜上，最后进行蛋白印迹分析，即采用抗人PC4的多克隆抗体来检测被转到硝酸纤维膜上的蛋白。 结果如图8B所示，该结果表明在很多人体肿瘤组织中，如肺癌组织、膀胱癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、子宫内膜癌组织、甲状腺癌组织和小肠癌组织，都发现了 PC4，但是在相应的正常人体组织中都没有检测到PC4。专利技术人还采用免疫组织化学分析检测了正常肺组织和肺癌组织中PC4蛋白的表达水平。用美国国立卫生研究院提供的正常肺组织或肺癌组织切片的载玻片样本做免疫组织化学分析。免疫组织化学分析过程如下先用二甲苯处理组织切片的载玻片，2次，每次 15分钟；然后将其置入浓度依次递减的(从100% 70%)的乙醇中，每次孵育5分钟；在 95°C下烘干5分钟后，依次用水和PBS漂洗，然后用3%牛奶封闭液进行封片；加一抗(即抗PC4的抗体)，室温孵育1小时；洗去多余的一抗后，向切片加标记有荧光的二抗，室温孵育30分钟；最后，漂洗载玻片，放置在荧光显微镜下能检测到PC4蛋白。如图9A和图9B所示，正常肺组织中没有检测到PC4蛋白，而在肺癌组织的所有癌细胞中都发现PC4蛋白的凝集。专利技术人在所有经检测的转化细胞系(cos、HeLaJ93)和三个乳腺癌细胞系 ((MCF7、MD231、MDA468)中都检测到了 PC4的mRNA，但是在原代NIH3T3细胞系和非恶性的大鼠组织(脑组织m-Brain，睾丸组织m-Testis)没有检测到PC4的mRNA。检测方法(Northern印迹分析)如下从上述这些不同细胞系或组织中提取总RNA且通过1 %的甲醛-琼脂糖凝胶进行分离，凝胶上的RNA转到硝酸纤维膜上后，再将标记有32P的人 PC4DNA (h-PC4 probe)和人p52 DNA (h-p52 probe)作为探针分别与所提取的总RNA杂交 (将膜置于探针溶液环境中孵育一段时间)，用溴化乙锭(EtBr)染色法分别检测出各样品总RNA中PC4 mRNA和p52 mRNA的表达水平，即观测染色后的28S和18S核糖体RNA (参见文献Ge等，EMBO本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种治疗或预防癌症的药物，所述的药物包含了有效剂量的ＰＣ４拮抗剂，其特征在于： 所述的ＰＣ４拮抗剂为单克隆抗ＰＣ４抗体或含有所述单克隆抗ＰＣ４抗体的多克隆抗体，所述单克隆抗ＰＣ４抗体为ＰＣ４的亚型特异性抗体，且为结构域抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛辉，
申请(专利权)人：苏州爱生基因有限公司，
类型：发明
国别省市：32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。