一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，它涉及一种厌氧细菌的分离方法。本发明专利技术解决了现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题。方法：一、提取DNA、PCR扩增；二、分离培养、纯化培养和富集培养；三、PCR扩增；四、分离培养、纯化培养和富集培养；五、PCR扩增；六、分离培养、纯化培养和富集培养即得到同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌。本发明专利技术的分离方法，与现有厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌的分离方法相比，周期缩短了40%~50%，工作量小，周期短；本发明专利技术的分离方法得了目的菌株的纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种厌氧细菌的分离方法。
技术介绍
可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌主要用于含有硫酸盐和硝酸盐污水的处理，该功能菌株快速分离和鉴定对于污水处理工艺的改进以及污水处理的效能提高具有重要的意义，同时该菌株在微生物降解机理研究方面具有重要的科研价值。目前，现有可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法对厌氧环境要求严格，厌氧条件控制困难，分离过程中工作量大，分离周期较长，同时现有的分离方法不易获得纯菌株，还存在即使获得了菌株，却不是目的功能菌株，而且非目的菌株对硫酸盐、硝酸盐和亚硝酸的降解效果不好。可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌分离困难，导致许多的基础理论的研究无法进行，且随着环境的日益恶化，特别是工业废水硫酸盐和硝酸盐污染的加剧，可同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离和相关的研究凸显出重要性。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有分离同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的方法分离周期较长、不易获得纯菌株的问题，而提供了。本专利技术同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行 一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行 PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A ；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌I ；四、细菌I经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B ；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌II ；六、 细菌II经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5’- AC[C/G]CACTGGAAGCACG _3’，下游引物为5’ -TGCCGAGGAGAACGATGTC-3’，第一套引物对应的PCR扩增程序为94°C预热5min、94°C 变性30s、56°C复性45s、72°C延伸90s、循环30次和72°C延伸lOmin，PCR扩增的反应体系由 2μ L 的 IOXPCR Buffer,2y L 的 dNTPs (0. 3mmol/L)、1 μ L 的浓度为 0. 1 μ mol/L 的上游引物、1 μ L的浓度为0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的浓度为0. 3U/μ L的rT^ E和2yL的浓度为2yg/L的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为 5' - TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3，，下游引物为 5，- AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG -3，，第二套引物对应的PCR扩增程序为94°C预热5min、94°C变性30s、55°C复性45s、72°C延伸90s、循环30次和72°C延伸lOmin，PCR扩增的反应体系由2 μ L的IOXPCR Buffer,2 μ L的浓度为0. 3mmol/L的dNIPs、l μ L的浓度为0. 1 μ mol/L的上游引物、1 μ L的浓度为0. 1 μ mol/ L的下游引物、0. 3 μ L的浓度为0. 3U/ μ L的rT^ Ε、2 μ L的浓度为2 μ g/L的DNA样品和 20 μ L的dH20组成。本专利技术中的步骤二和步骤四中的分离培养方法均为待分离的厌氧细菌接种于液态培养基中，采用亨盖特厌氧滚管技术进行分离培养，然后对分离培养得到的菌株进行检验，筛选出同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌，其中，培养温度为35 38°C，培养时间为 7 12天；其中液态培养基由 4g Na2SO4J-Og KNO3、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7Η20、0· 5g K2HPO4, 5g酒石酸钾钠、1. Og KH2P04、0. 2g CaCl2 ·2Η20和1750mL蒸馏水组成，pH为7. 5 ；亨盖特厌氧滚管技术中所使用的固体培养基由4g Na2SO4,2. Og KN03、2. Og NaNO3Ug MgSO4 ·7H20、0. 5g K2HPO4,5g 酒石酸钾钠、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2H20、12g 琼脂和 1750mL 蒸馏水组成，pH 为7. 5 ；步骤二和步骤四中的纯化培养的方法均为分离培养得到的细菌接种于固体培养基中在35 38°C条件下培养5 14天得到单菌落；其中固体培养基由4g Na2S04、2.0g KNO3, 2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸钾钠、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2Η20、 12 g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5 ；步骤二和步骤四中的富集培养的方法均为纯化培养得到的细菌接种于液体培养基中，在35 38°C条件下富集培养7 14天得到菌液，然后同时采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，将同时能够扩增出的条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中液态培养基由4g Na2SO4,2. Og ΚΝ03、 2. Og NaNO3Ug MgSO4 · 7Η20、0· 5g K2HP04、5g 酒石酸钾钠、1. Og ΚΗ2Ρ04、0· 2g CaCl2 · 2Η20 禾口 1750mL蒸馏水组成，pH为7. 5。本专利技术的分离方法，与现有厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌的分离方法相比， 周期缩短了 409Γ50%，工作量小，周期短；通过两组特异性引物的PCR扩增，能有针对性的快速的分离，避免了非厌氧同时硫酸盐还原和反硝化细菌对检测的干扰，使得整个实验结果误差小，准确可靠，本专利技术的分离方法得了目的菌株的纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。附图说明图1为具体实施方式五中的厌氧细菌的二维扫描电镜图； 图2为具体实施方式五中的厌氧细菌的三维扫描电镜图3为具体实施方式五中的系统发育树；图4为具体实施方式五中的厌氧细菌对Ν03_和Ν02_的降解效果图，图中—表示 NO2^的浓度，-A-表示NO3-的浓度，-δ—表示NO3-的降解率；图5为具体实施方式五中的厌氧细菌对S042_的降解效果图，-▲一表示S042_的浓度， -^表示S042_的去除率；图6为具体实施方式五的分离方法的工艺流程图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总 DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，其特征在于同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用ＤＮＡ抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总ＤＮＡ，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因ｎｉｓ Ｋ基因的序列，采用两套特异性引物，进行ＰＣＲ扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液Ａ；三、菌液Ａ采用两套特异性引物对菌液中细菌的 ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和ｎｉｓ Ｋ基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液Ｂ；五、菌液Ｂ采用两套特异性引物对菌液中细菌的 ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和ｎｉｓ Ｋ基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行ＰＣＲ扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为５＇－ ＡＣ［Ｃ／Ｇ］ＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＧ－３＇，下游引物为５＇－ＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣ－３＇，第一套引物对应的ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预热５ｍｉｎ、９４℃变性３０ｓ、５６℃复性４５ｓ、７２℃延伸９０ｓ、循环３０次和７２℃延伸１０ｍｉｎ，ＰＣＲ扩增的反应体系由２μＬ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、２μＬ的浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ 的ｄＮＴＰｓ、１μＬ的浓度为０．１μｍｏｌ／Ｌ的上游引物、１μＬ的浓度为０．１μｍｏｌ／Ｌ的下游引物、０．３μＬ的浓度为０．３Ｕ／μＬ的ｒＴａｑ Ｅ和２μＬ的浓度为２μｇ／Ｌ 的ＤＮＡ样品组成；第二套反硝化的特异基因ｎｉｓ Ｋ基因上游引物为５＇－ ＴＣＡＣＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＴ－３＇，下游引物为５＇－ＡＧＫＣＧＴＴＧＡＡＣＴＴＫＣＣＧＧＴＣＧＧ－３＇，第二套引物对应的ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预热５ｍｉｎ、９４℃变性３０ｓ、５５℃复性４５ｓ、７２℃延伸９０ｓ、循环３０次和７２℃延伸１０ｍｉｎ， ＰＣＲ扩增的反应体系由２μＬ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、２μＬ的浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ、１μＬ的浓度为０．１μｍｏｌ／Ｌ的上游引物、１μＬ的浓度为０．１μｍｏｌ／Ｌ的下游引物、０．３μＬ的浓度为０．３Ｕ／μＬ的ｒＴａｑ Ｅ、２μＬ的浓度为２μｇ／Ｌ 的ＤＮＡ样品和２０μＬ的ｄＨ２Ｏ组成。...
【技术特征摘要】
1.一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，其特征在于同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行一、对环境样本采用DNA 抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A ；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌I ；四、细菌I经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B;五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌II ；六、细菌II经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5’- AC[C/G]CACTGGAAGCACG-3'，下游引物为 5' -TGCCGAGGAGAACGATGTC-3’，第一套引物对应的PCR扩增程序为94°C预热5min、94°C变性30s、56°C复性45s、72°C延伸90s、循环30次和72°C延伸IOmin, PCR扩增的反应体系由 2μ L 的 10XPCR Buffer、2y L 的浓度为 0. 3mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 的浓度为 0. 1 μ mol/L 的上游引物、1 μ L的浓度为0. 1 μ mol/L的下游引物、0. 3 μ L的浓度为0. 3U/μ L的rhg E 和2yL的浓度为2yg/L的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为 5，- TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3，，下游引物为 5，-AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3，，第二套引物对应的PCR扩增程序为94°C预热5min、94°C变性30s、55°C复性45s、72°C延伸90s、循环30次和72°C延伸lOmin，PCR扩增的反应体系由2 μ L的10XPCR Buffer,2 μ L的浓度为0. 3mmol/L的dNIPs、l μ L的...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏利，李春颖，代阳，赵光，王哲，孙伟，王博，于申，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93
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