本发明专利技术涉及属于植物检疫技术研究领域。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量5?g±0.5?g；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8～2；（4）易溶于水，或TE（Tris-EDTA）缓冲液中。本发明专利技术油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料，通过特定条件大量培养，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到油菜茎基溃疡病菌的分子标准品，理化性质优异，可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到10-4倍。经检测试验，该标准品DNA完整性、均匀性、稳定性好，可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，另外本专利技术还涉及其制备方法，属于植物检疫技术研究领域。
技术介绍
国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多，而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步，很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心(ATCC)的菌株作为阳性对照，其价格非常昂贵，国内几乎无法购买到，而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道，所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子 DNA标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供和应用说明。本专利技术油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度 DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量 5μδ 士0. ;(3)DNA 纯度:0D260/280=1. 8 2 ； (4)易溶于水，或 TE (Tris-EDTA)缓冲液中。所述DNA 纯度0D260/280=1. 85。本专利技术油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，包括如下步骤(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基，置于20 22°C条件下培养5 7天；(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA，采用CTAB方法提取DNA；(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按士0.5μδ /管进行分装，每种核酸分子标样分装100-400管，然后冻干，即为目的标准品。所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA，包括如下步骤①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入 1.5 ml的离心管中(同时做多管)；②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ 65°C预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混勻，65°C水浴50 min，每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；③冷却至室温，再向②中离心管加入800μ 1的氯仿异戊醇混合液(体积比为M :1)， 轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿异戊醇混合液(体积比为M 1)，轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混勻，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4°C 12000 rpm离心10 min,弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800 μ 1浓度70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800 μ 1浓度70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min,4°C 10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800 μ 1浓度70 %冰乙醇洗DNA 沉淀，方法同上，4°C 15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ 1 TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后，加入3 μ 1 RNase(10 mg/ml)，37°C水浴30 min ；然后按③一⑤步相同处理方法进行处理；⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀，用100μ TE溶解，-20°C保存备用。 所述对标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析， 来确认所制备的核酸为目的DNA 取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物 Phom I和Wlom II进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品，正向引物5' - CACCAATTGGATCCCCTA -3，反向引物5，- AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA -3，反应体系模板1 2正向引物1 μ 反向引物1 μ iTaq 酶0. 2UdNTP4 μ IOXBuffer3 μ Total30 μ 反应条件940C 3min 94°C 30s 53°C 30s72°C 40s循环；35 次72 °C 5min。本专利技术油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料，通过特定条件大量培养，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到油菜茎基溃疡病菌的分子标准品，理化性质优异，可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到 10_4倍。经检测试验，该标准品DNA完整性、均勻性、稳定性好，可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。四附图说明图1是油菜茎基溃疡病菌总DNA电泳图。图2是油菜茎基溃疡病菌特异性引物扩增电泳结果图，其中1、2、3为目的DNA。图3是本专利技术标准样品灵敏度检测结果图，其中由左到右，每两格为一组，依次是 IO"1, IO"2, 10_3，10_4，10_5。五具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术并不局限于具体实施例。实施例1油菜茎基溃疡病菌分子标准样品制备方法按如下步骤进行(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基，置于20 22°C条件下培养5 7天。(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA，采用CTAB方法提取DNA，具体步骤如下①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入 1.5 ml的离心管中(同时做多管)；②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ 65°C预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混勻，65°C水浴50 min，每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；③冷却至室温，再向②中离心管加入800μ 1的氯仿异戊醇混合液(体积比为M :1)， 轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿异戊醇混合液(体积比为M 1)，轻轻颠倒混勻，静置10 min,40C 10000 rpm离心10 min，取上清；⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混勻，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4°C 12000 rpm离心10 min, 弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800 μ 1 70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800 μ 1 70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min,4°C 10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800 μ 1 70 %冰乙醇洗DNA沉淀，方法同上， 40C 15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ 1 TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后，加入3 μ 1 RNase(10 mg/ml)，37°C水浴30 min ；然后按③一⑤步相同处理方法进行处理；⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀，用100μ TE溶解，-20°C保存备用。(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按管进行分装，每种核酸分子标样分装150管，然后冻干，即为目的标准品，具有下述的理化性质形状纯白色粉末状；每管的含量士0· 5μδ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，其特征在于：以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度ＤＮＡ为原料制得，标准样品具有下述的理化性质：（１）形状：纯白色粉末状；（２）每管的含量５μｇ ±０．５μｇ；（３）ＤＮＡ纯度：ＯＤ２６０／２８０＝１．８～２；（４）易溶于水，或ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）缓冲液中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫，刘冉，曹际娟，王有福，
申请(专利权)人：李鑫，刘冉，曹际娟，王有福，
类型：发明
国别省市：91
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